JoVE Journal > Developmental Biology
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Abstract
Introduction
Protocol
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Biologie du développement

Stabilire i requisiti di impollinazione nella prugna giapponese mediante monitoraggio fenologico, impollinazione manuale, microscopia a fluorescenza e genotipizzazione molecolare

Published: November 09, 2020
doi:
10.3791/61897
, ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza),Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX),Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

Summary

Viene descritta una metodologia per la determinazione dei requisiti di impollinazione negli ibridi giapponesi di tipo prugna, che combina le impollinazioni sul campo e in laboratorio e le osservazioni dei tubi pollinici sotto la microscopia a fluorescenza con l’identificazione dei genotipi Smediante PCR e il monitoraggio della fioritura per la selezione degli impollinatori.

Abstract

Le cultivar di prugne giapponesi comunemente coltivate sono ibridi interspecifici derivati da incroci tra l’originale Prunus salicina con altre specie di Prunus. La maggior parte degli ibridi presenta un’auto-incompatibilità gametofita, che è controllata da un singolo e altamente polimorfo S-locus che contiene più alleli. La maggior parte degli ibridi coltivati sono auto-incompatibili e hanno bisogno di polline da un donatore compatibile per fertilizzare i loro fiori. Stabilire i requisiti di impollinazione nella prugna giapponese sta diventando sempre più importante a causa dell’elevato numero di nuove cultivar con requisiti di impollinazione sconosciuti. In questo lavoro, viene descritta una metodologia per la determinazione dei requisiti di impollinazione negli ibridi giapponesi di tipo prugna. L’auto(in)compatibilità è determinata dall’impollinazione manuale sia sul campo che in laboratorio, seguita dal monitoraggio dell’allungamento del tubo pollinico con microscopia a fluorescenza e anche dal monitoraggio della maturazione dei frutti sul campo. La selezione delle cultivar impollinatori viene valutata combinando l’identificazione dei genotipi Smediante analisi PCR con il monitoraggio del tempo di fioritura in campo. Conoscere le esigenze di impollinazione delle cultivar facilita la selezione delle cultivar per la progettazione di nuovi frutteti e consente la diagnosi precoce dei problemi di produttività legati alla carenza di impollinazione nei frutteti consolidati.

Introduction

La prugna giapponese (Prunus salicina Lindl.) è originaria della Cina1. Nel 19 ° secolo, questacoltura è stata introdotta dal Giappone negli Stati Uniti, dove è stata incrociata con altre prugne diploidi nordamericane2. Nel 20° secolo, alcuni di questi ibridi sono stati diffusi nelle regioni temperate di tutto il mondo. Al giorno d’oggi, il termine “prugna giapponese” si riferisce a una vasta gamma di ibridi interspecifici derivati da incroci tra l’originale P. salicina con fino a 15 altri diploidi Prunus spp.3,4,5.

La prugna giapponese, come altre specie della famiglia delle Rosacee, presenta l’auto-incompatibilità gametofita (GSI), che è controllata da un singolo e altamente polimorfo S-locuscontenente più alleli6. Il -locus Scontiene due geni che codificano per una ribonucleasi (S-RNasi) espressa nel pistillo, e una proteina F-box (SFB) espressa nel granello di polline7. Nella reazione di auto-incompatibilità, quando l’allele Sespresso nel granello di polline (aploide) è lo stesso di uno dei due espressi nel pistillo (diploide), la crescita del tubo pollinico attraverso lo stile viene arrestata a causa della degradazione dell’RNA del tubo pollinico da parte dell’azione della S-RNasi8. Poiché questo processo impedisce la fecondazione del gametofito femminile nell’ovulo, GSI promuove l’outcrossing tra cultivar.

Sebbene alcune cultivar di prugne giapponesi siano autocompatibili, la maggior parte delle cultivar attualmente coltivate sono auto-incompatibili e hanno bisogno di polline da donatori intercompatibili per fertilizzare i loro fiori3. Nelle specie di drupacee del genere Prunus come la mandorla9,l’albicocca10,11, 12 e la ciliegiadolce 13,i requisiti di impollinazione delle cultivar possono essere stabiliti da diversi approcci. L’auto-(in)compatibilità può essere determinata dall’autoimpollinazione dei fiori in campo e dal successivo monitoraggio dell’allegagione, o dalle autoimpollinazioni semi-in vivo in condizioni controllate in laboratorio e dall’osservazione di tubi di polline al microscopio14,15,16,17,18 . Le relazioni di incompatibilità tra cultivar possono essere determinate da impollinazioni incrociate in campo o in laboratorio utilizzando polline della cultivar potenziale impollinatrice e dall’identificazione diS-alleli di ciascuna cultivar mediante analisi PCR14,15,16,19,20,21,22 . In specie come la ciliegia dolce o la mandorla, l’auto(in)compatibilità può essere valutata anche mediante l’identificazione di particolari alleli S associati all’autocompatibilità, come S4′ nella ciliegia dolce13 o Sf nella mandorla23.

Diversi programmi di allevamento di prugne dei principali paesi produttori stanno rilasciando una serie di nuove cultivar2,14,molte delle quali con requisiti di impollinazione sconosciuti. In questo lavoro, viene descritta una metodologia per la determinazione dei requisiti di impollinazione negli ibridi giapponesi di tipo prugna. L’auto-(in)compatibilità è determinata da autoimpollinazioni sia sul campo che in laboratorio, seguite da osservazioni di tubi di polline sotto la microscopia a fluorescenza. La selezione delle cultivar impollinatori combina l’identificazione dei genotipi Smediante analisi PCR con il monitoraggio del tempo di fioritura in campo.

Protocol

1. Impollinazione manuale sul campo Estrazione del polline Per ottenere il polline, raccogliere i boccioli di fiori allo stadio D24, secondo lo stadio 57 sulla scala BBCH25,26.NOTA: Sono necessari più boccioli di fiori nella prugna giapponese che in altre specie di Prunus perché le loro antere producono meno polline. Rimuovere le antere utilizzando una rete di plastica (dimens…

Representative Results

Ogni bocciolo di fiore di prugna giapponese contiene un’infiorescenza con 1-3 fiori. Come in altre specie di drupacee, ogni fiore è composto da quattro spirali: carpello, stami, petali e sepali, che si fondono formando una coppa alla base del fiore. Le strutture floreali sono più piccole di altri frutti a nocciolo, con un pistillo corto e fragile circondato dagli stami che contengono una piccola quantità di grani di polline. A piena fioritura, i fiori di ogni infiorescenza appaiono separati su brevi gambi, mostrando i…

Discussion

La metodologia qui descritta per i requisiti di impollinazione delle cultivar di prugne giapponesi richiede la determinazione dell’auto-(in)compatibilità di ciascuna cultivar mediante impollinazioni controllate sul campo o in laboratorio e la successiva osservazione della crescita del tubo pollinico con microscopia a fluorescenza. Le relazioni di incompatibilità sono stabilite dalla caratterizzazione degli alleli Smediante genotipizzazione molecolare. Infine, la selezione degli impollinatori viene eseguita dal…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata finanziata dall’Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 e RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón —Fondo sociale europeo, Unione europea (Grupo Consolidado A12-17R) e Junta de Extremadura —Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero è stato sostenuto da una borsa di studio del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología del Messico (CONACYT, 471839).

Materials

Acetic Acid Glacial Panreac 131008.1611
Agar iNtRON Biotechnology 25999
Aniline blue Difco 8504-88
Boric Acid (H3BO4) Panreac 131015.1210
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) Panreac 131231.1211
Coverglass Deltalab D102460 24 mm x 60 mm
Digital Camera Imaging Developmet Systems UI-1490SE
Digital Camera Software Suite Imaging Developmet Systems 4.93.0.
DNA Oligos ThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM each ThermoSischer Scientific R0193
DreamTaq Green DNA polymerase ThermoFisher Scientific EP0713
Ethanol 96° VWR-Chemicals 83804.360
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) Invitrogen 15615-016 Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl
Gel Documentation System Bio-Rad 1708195
Hand Counter Tamaco TM-4
Image Lab Software Bio-Rad Image Analyse System for Gel Documentation System
MetaPhor Agarose Lonza 50180
Microcentrifuge 5415 R Eppendorf Z605212
Microscope with UV epiflurescence Leica DM2500 Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425
Microslides Deltalab D100004 26 mm x 76 mm
Mini Electrophoresis System Fisherbrand 14955170
Minicentrifuge ThermoFisher Scientific 15334204
NanoDrop 1000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND1000
Petri Dishes Deltalab 200201 55 mm x 14 mm
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) Panreac 141513
Primer forward 'Pru C2' ThermoFisher Scientific
Primer forward Pru T2' ThermoFisher Scientific
Primer reverse 'PCER' ThermoFisher Scientific
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution iNtRON Biotechnology 21141
Saccharose Panreac 131621.1211
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) Panreac 131717.1211
Speedtools plant DNA extraction Kit Biotools 21272
TBE Buffer (10X) Panreac A0972,5000PE
Thermal Cycler T100 Bio-Rad 1861096
Thermomixer comfort Eppendorf T1317
Vertical Autoclave Presoclave II JP Selecta 4001725
Vortex Fisherbrand 11746744
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Pollination RequirementsJapanese PlumPhenological MonitoringHand PollinationsFluorescence MicroscopyMolecular GenotypingSelf-incompatible CultivarsPollen ExtractionBBCH ScaleFruit SetSelf-pollinationCross-pollinationPollen GerminationFixative SolutionMicroscopy

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Citer Cet Article
Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping. J. Vis. Exp. (165), e61897, doi:10.3791/61897 (2020).
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