Установление требований к опылению японской сливы с помощью фенологического мониторинга, ручного опыления, флуоресцентной микроскопии и молекулярного генотипирования
Summary
Описана методика определения потребностей в опылении у гибридов японского сливового типа, сочетающая полевые и лабораторные опыления и наблюдения пыльцевых пробирок под флуоресцентной микроскопией с идентификацией S-генотипов методом ПЦР и мониторингом цветения для селекции опылителей.
Abstract
Японские сорта сливы, обычно выращиваемые, являются межвидовыми гибридами, полученными из скрещиваний между оригинальным Prunus salicina с другими видами Prunus. Большинство гибридов демонстрируют гейметофитную самосовместимость, которая контролируется одним и высокополиморфным S-локусом, содержащим несколько аллелей. Большинство культивируемых гибридов самонесоотсоотвращны и нуждаются в пыльце от совместимого донора для удобрения своих цветов. Установление требований к опылению японской сливы становится все более важным из-за большого количества новых сортов с неизвестными требованиями к опылению. В данной работе описана методология определения требований к опылению у гибридов японского сливового типа. Самосовместимость определяется ручным опылением как в полевых условиях, так и в лаборатории с последующим мониторингом удлинения пыльцевой трубки с помощью флуоресцентной микроскопии, а также мониторингом созревания плодов в полевых условиях. Селекция сортов опылителей оценивается путем совмещения идентификации S-генотипов методом ПЦР-анализа с мониторингом времени цветения в полевых условиях. Знание требований к опылению сортов облегчает отбор сортов для проектирования новых садов и позволяет своевременно выявлять проблемы продуктивности, связанные с дефицитом опыления в установленных садах.
Introduction
Японская слива (Prunus salicina Lindl.) родом из Китая1. В 19веке эта культура была завезена из Японии в США, где ее скрещивали с другими североамериканскими диплоидными сливами2. В20-м веке некоторые из этих гибридов были распространены в умеренных регионах по всему миру. В настоящее время термин «японская слива» относится к широкому кругу межвидовых гибридов, полученных из скрещива между оригинальным P. salicina с 15 другими диплоидами Prunus spp.3,4,5.
Японская слива, как и другие виды семейства Rosaceae, демонстрирует гаметофитную самонесовместимость (GSI), которая контролируется одним и высокополиморфным S-локусом, содержащим несколько аллелей6. S-локус содержит два гена, которые кодируют рибонуклеазу(S-РНКазу),экспрессируемую в пестике, и белок F-бокса (SFB), экспрессируемый в пыльцевомзерне 7. В реакции самосовместимости, когда S-аллель, экспрессируемый в пыльцевом зерне (гаплоиде), такой же, как один из двух, экспрессируемых в пестике (диплоид), рост пыльцевой трубки по всему стилю остановлен из-за деградации РНК пыльцевой трубки действием S-РНКазы8. Поскольку этот процесс препятствует оплодотворению женского гаметофита в яйцеклетке, GSI способствует ауткроссингу между сортами.
Хотя некоторые японские сорта сливы являются самосовместимыми, большинство выращиваемых в настоящее время сортов являются самонесостоятельными и нуждаются в пыльце от совместимых доноров для удобрения своих цветов3. У косточковых видов рода Prunus, таких как миндаль9,абрикос10,11,12 и черешня13,требования к опылению сортов могут быть установлены различными подходами. Самосовместимость может быть определена путем самоопыления цветов в поле и последующего мониторинга плодового заготовления, или путем полу-in vivo самоопыления в контролируемых условиях в лабораторных условиях и наблюдения пыльцевых трубок под микроскопом14,15,16,17,18 . Отношения несовместимости между сортами могут быть определены путем перекрестного опыления в полевых условиях или лаборатории с использованием пыльцы потенциального сорта опылителя, а также путем идентификации S-аллелей каждого сорта методом ПЦР-анализа14,15,16,19,20,21,22 . У таких видов, как черешня или миндаль, самосовместимость также может быть оценена путем идентификации конкретных аллелей S, связанных с самосовместимостью, таких как S4‘ в черешне13 или Sf в миндале23.
Несколько программ по разведению сливы из основных стран-производителей выпускают ряд новых сортов2,14,многие из которых с неизвестными требованиями к опылению. В данной работе описана методология определения требований к опылению у гибридов японского сливового типа. Самосовместимость определяется самоопылениями как в полевых условиях, так и в лаборатории с последующими наблюдениями пыльцевых трубок под флуоресцентной микроскопией. Селекция сортов опылителей сочетает в себе идентификацию S-генотипов методом ПЦР-анализа с мониторингом времени цветения в полевых условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методология, описанная в настоящем описании для потребностей в опылении японских сортов сливы, требует определения самосовместимости каждого сорта путем контролируемого опыления в полевых условиях или лаборатории и последующего наблюдения за ростом пыльцевой трубки с помощью флуор…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 и RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón — Европейский социальный фонд, Европейский союз (Grupo Consolidado A12-17R) и Хунта Эстремадура — Европейский фонд регионального развития (FEDER), Региональный план исследований (IB16181), Группа исследований (AGA001, GR18196). Б.И. Герреро был поддержан стипендией Национального совета по вопросам науки и технологии Мексики (CONACYT, 471839).
Materials
| Acetic Acid Glacial | Panreac | 131008.1611 | |
| Agar | iNtRON Biotechnology | 25999 | |
| Aniline blue | Difco | 8504-88 | |
| Boric Acid (H3BO4) | Panreac | 131015.1210 | |
| Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) | Panreac | 131231.1211 | |
| Coverglass | Deltalab | D102460 | 24 mm x 60 mm |
| Digital Camera | Imaging Developmet Systems | UI-1490SE | |
| Digital Camera Software Suite | Imaging Developmet Systems | 4.93.0. | |
| DNA Oligos | ThermoFisher Scientific | ||
| dNTP Mix, 10 mM each | ThermoSischer Scientific | R0193 | |
| DreamTaq Green DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | EP0713 | |
| Ethanol 96° | VWR-Chemicals | 83804.360 | |
| 1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) | Invitrogen | 15615-016 | Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | 1708195 | |
| Hand Counter | Tamaco | TM-4 | |
| Image Lab Software | Bio-Rad | Image Analyse System for Gel Documentation System | |
| MetaPhor Agarose | Lonza | 50180 | |
| Microcentrifuge 5415 R | Eppendorf | Z605212 | |
| Microscope with UV epiflurescence | Leica | DM2500 | Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425 |
| Microslides | Deltalab | D100004 | 26 mm x 76 mm |
| Mini Electrophoresis System | Fisherbrand | 14955170 | |
| Minicentrifuge | ThermoFisher Scientific | 15334204 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND1000 | |
| Petri Dishes | Deltalab | 200201 | 55 mm x 14 mm |
| Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) | Panreac | 141513 | |
| Primer forward 'Pru C2' | ThermoFisher Scientific | ||
| Primer forward Pru T2' | ThermoFisher Scientific | ||
| Primer reverse 'PCER' | ThermoFisher Scientific | ||
| RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | iNtRON Biotechnology | 21141 | |
| Saccharose | Panreac | 131621.1211 | |
| Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) | Panreac | 131717.1211 | |
| Speedtools plant DNA extraction Kit | Biotools | 21272 | |
| TBE Buffer (10X) | Panreac | A0972,5000PE | |
| Thermal Cycler T100 | Bio-Rad | 1861096 | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | T1317 | |
| Vertical Autoclave Presoclave II | JP Selecta | 4001725 | |
| Vortex | Fisherbrand | 11746744 |
References
- Hendrick, U. P. . The Plums of New York. , (1911).
- Okie, W. R., Hancock, J. F., Hancock, J. F. Plums. Temperate Fruit Crop Breeding. , 337-357 (2008).
- Guerra, M. E., Rodrigo, J. Japanese plum pollination: a review. Scientia Horticulturae. 197, 674-686 (2015).
- Okie, W. R. Introgression of Prunus species in plum. New York Fruit Quarterly. 14 (1), 29-37 (2006).
- Okie, W. R., Weinberger, J. H., Janick, J., Moore, J. . Fruit Breeding, vol. 1. Tree and tropical fruits. , 559-608 (1996).
- Mccubbin, A. G., Kao, T. Molecular recognition and response in pollen and pistil interactions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 333-364 (2000).
- Hegedűs, A., Halász, J. Recent findings of the tree fruit self-incompatibility studies. International Journal of Horticultural Science. 13 (2), 7-15 (2007).
- de Nettancourt, D. . Incompatibility and Incongruity in Wild and Cultivated Plants. , (2001).
- Tao, R., et al. Identification of stylar RNases associated with gametophytic self-incompatibility in almond (Prunus dulcis). Plant and Cell Physiology. 38 (3), 304-311 (1997).
- Halász, J., Pedryc, A., Ercisli, S., Yilmaz, K., Hegedűs, A. S-genotyping supports the genetic relationships between Turkish and Hungarian apricot germplasm. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (5), 410-417 (2010).
- Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Self-incompatibility and S-allele identification in new apricot cultivars. Acta Horticulturae. (1231), 171-176 (2019).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
- Cachi, A. M., Wunsch, A. Characterization of self-compatibility in sweet cherry varieties by crossing experiments and molecular genetic analysis. Tree Genetics & Genomes. 10, 1205-1212 (2014).
- Guerra, M. E., Guerrero, B. I., Casadomet, C., Rodrigo, J. Self-compatibility, S-RNase allele identification, and selection of pollinizers in new Japanese plum-type cultivars. Scientia Horticulturae. 261, 109022 (2020).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 1-12 (2018).
- Herrera, S., Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Lora, J. Identification of self-incompatibility alleles by specific PCR analysis and S-RNase sequencing in apricot. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3612 (2018).
- Sociasi Company, R., Kodad, O., Fernández i Martí, J. M., Alonso, J. M. Mutations conferring self-compatibility in Prunus species: from deletions and insertions to epigenetic alterations. Scientia Horticulturae. 192, 125-131 (2015).
- Rodrigo, J., Herrero, M. Evaluation of pollination as the cause of erratic fruit set in apricot ‘Moniqui. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 71 (5), 801-805 (1996).
- Beppu, K., et al. Se-haplotype confers self-compatibility in Japanese plum (Prunus salicina Lindl). Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 80 (6), 760-764 (2005).
- Guerra, M. E., Rodrigo, J., López-Corrales, M., Wünsch, A. S-RNase genotyping and incompatibility group assignment by PCR and pollination experiments in Japanese plum. Plant Breeding. 128 (3), 304-311 (2009).
- Guerra, M. E., Wunsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Flower emasculation as the cause for lack of fruit set in Japanese plum crosses. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (6), 556-562 (2010).
- Guerra, M. E., Wünsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Lack of fruit set caused by ovule degeneration in Japanese plum. Journal of the American Society for Horticultural Science. 136 (6), 375-381 (2011).
- Fernández i Martí, A., Gradziel, T. M., Socias i Company, R. Methylation of the Sf locus in almond is associated with S-RNase loss of function. Plant Molecular Biology. 86, 681-689 (2014).
- Baggiolini, M. Les stades repérés des arbres fruitiers à noyau. Revue romande d’Agriculture et d’Arboriculture. 8, 3-4 (1952).
- Meier, U. Growth stages of mono-and dicotyledonous plants: BBCH Monograph. Federal Biological Research Centre for Agriculture and Forestry. , (2001).
- Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Flower development in sweet cherry framed in the BBCH scale. Scientia Horticulturae. 192, 141-147 (2015).
- Fadon, E., Rodrigo, J. Combining histochemical staining and image analysis to quantify starch in the ovary primordia of sweet cherry during winter dormancy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Hormaza, J. I., Pinney, K., Polito, V. S. Correlation in the tolerance to ozone between sporophytes and male gametophytes of several fruit and nut tree species (Rosaceae). Sexual Plant Reproduction. 9, 44-48 (1996).
- Burgos, L., et al. The self-compatibility trait of the main apricot cultivars and new selections from breeding programmes. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 72 (1), 147-154 (1997).
- Dicenta, F., Ortega, E., Cánovas, J. A., Egea, J. Self-pollination vs. cross-pollination in almond: pollen tube growth, fruit set and fruit characteristics. Plant Breeding. 121, 163-167 (2002).
- Alonso, J. M., Socias i Company, R. Differential pollen tube growth in inbred self-compatible almond genotypes. Euphytica. 144, 207-213 (2005).
- Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. The effect of temperature on pollen germination, pollen tube growth, and stigmatic receptivity in peach. Plant Biology. 7, 476-483 (2005).
- Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. Warm temperatures at bloom reduce fruit set in sweet cherry. Journal of Applied Botany. 81, 158-164 (2007).
- Milatović, D., Nikolić, D. Analysis of self-(in)compatibility in apricot cultivars using fluorescence microscopy. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 82, 170-174 (2007).
- Jia, H. J., He, F. J., Xiong, C. Z., Zhu, F. R., Okamoto, G. Influences of cross pollination on pollen tube growth and fruit set in Zuili plums (Prunus salicina). Journal of Integrative Plant Biology. 50, 203-209 (2008).
- Herrero, M., Salvador, J. La polinización del ciruelo Red Beaut. Información Técnica Econónomica Agraria. 41, 3-7 (1980).
- Ramming, D. W. Plum. Register of new fruit and nut varieties: Brooks and Olmo, List 37. HortScience. 30 (6), 1142-1144 (1995).
- Hartmann, W., Neümuller, M. Plum breeding. Breeding plantation tree crops: Temperate species. , 161-231 (2009).
- Guerra, M. E., López-Corrales, M., Wünsch, A. Improved S-genotyping and new incompatibility groups in Japanese plum. Euphytica. 186 (2), 445-452 (2012).
- Tao, R., et al. Molecular typing of S-alleles through identification, characterization and cDNA cloning for S-RNases in sweet cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science. 124 (3), 224-233 (1999).
- Yamane, H., Tao, R., Sugiura, A., Hauck, N. R., Lezzoni, A. F. Identification and characterization of S-RNases in tetraploid sour cherry (Prunus cerasus). Journal of the American Society for Horticultural Science. 126, 661-667 (2001).
- López, M., Jose, F., Vargas, F. J., Battle, I. Self-(in)compatibility almond genotypes: a review. Euphytica. 150, 1-16 (2006).
- Bošković, R., Tobutt, K. R. Correlation of stylar ribonuclease zymograms with incompatibility alleles in sweet cherry. Euphytica. 90, 245-250 (1996).
- Beppu, K., Syogase, K., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Inheritance of self-compatibility conferred by the Se-haplotype of Japanese plum and development of Se-RNase gene-specific PCR primers. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 85, 215-218 (2010).
- Beppu, K., Kumai, M., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Molecular and genetic analyses of the S-haplotype of the self-compatible Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) “Methley”. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 87 (5), 493-498 (2012).
- Beppu, K., Konishi, K., Kataoka, I. S-haplotypes and self-compatibility of the Japanese plum cultivar ‘Karari’. Acta Horticulturae. 929, 261-266 (2012).
- Sapir, G., Stern, R. A., Shafir, S., Goldway, M. S-RNase based S-genotyping of Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) and its implication on the assortment of cultivar-couples in the orchard. Scientia Horticulturae. 118, 8-13 (2008).
- Karp, D. Luther Burbank’s plums. HortScience. 50 (2), 189-194 (2015).
