Ermittlung der Bestäubungsanforderungen in japanischen Pflaumen durch phänologische Überwachung, Handbestäubung, Fluoreszenzmikroskopie und molekulare Genotypisierung
Summary
Es wird eine Methodik zur Bestimmung des Bestäubungsbedarfs bei japanischen Pflaumen-Hybriden beschrieben, die Feld- und Laborbestäubungen und Beobachtungen von Pollenröhren unter der Fluoreszenzmikroskopie mit der Identifizierung von S-Genotypen mittels PCR und der Überwachung der Blüte für die Auswahl von Bestäubern kombiniert.
Abstract
Die üblicherweise angebauten japanischen Pflaumensorten sind interspezifische Hybriden, die aus Kreuzungen zwischen dem ursprünglichen Prunus salicina und anderen Prunus-Arten stammen. Die meisten Hybriden weisen eine gametophytische Selbstinkompatibilität auf, die durch einen einzelnen und hochpolymorphen S-Locus gesteuert wird, der mehrere Allele enthält. Die meisten kultivierten Hybriden sind selbstinkompatibel und benötigen Pollen von einem kompatiblen Spender, um ihre Blüten zu befruchten. Die Etablierung von Bestäubungsanforderungen in japanischen Pflaumen wird aufgrund der hohen Anzahl neuer Sorten mit unbekanntem Bestäubungsbedarf immer wichtiger. In dieser Arbeit wird eine Methodik zur Bestimmung des Bestäubungsbedarfs in japanischen Pflaumen-Hybriden beschrieben. Die Selbst(in)Verträglichkeit wird durch Handbestäubungen sowohl im Feld als auch im Labor bestimmt, gefolgt von der Überwachung der Pollenröhrenverlängerung mit Fluoreszenzmikroskopie und der Überwachung der Fruchtreifung im Feld. Die Auswahl der Bestäubersorten wird bewertet, indem die Identifizierung von S-Genotypen durch PCR-Analyse mit der Überwachung der Blütezeit im Feld kombiniert wird. Die Kenntnis der Bestäubungsanforderungen von Sorten erleichtert die Auswahl von Sorten für die Gestaltung neuer Obstgärten und ermöglicht die frühzeitige Erkennung von Produktivitätsproblemen im Zusammenhang mit Bestäubungsmangel in etablierten Obstgärten.
Introduction
Japanische Pflaume (Prunus salicina Lindl.) stammt aus China1. Im19. Jahrhundert wurde diese Ernte von Japan in die Vereinigten Staaten eingeführt, wo sie mit anderen nordamerikanischen diploiden Pflaumen gekreuzt wurde2. Im20. Jahrhundert wurden einige dieser Hybriden in gemäßigte Regionen auf der ganzen Welt verbreitet. Heutzutage bezieht sich der Begriff “japanische Pflaume” auf eine breite Palette von interspezifischen Hybriden, die aus Kreuzungen zwischen der ursprünglichen P. salicina und bis zu 15 anderen diploiden Prunus spp.3,4,5abgeleitet sind.
Die japanische Pflaume weist wie andere Arten der Rosaceae-Familie eine gametophytische Selbstinkompatibilität (GSI) auf, die von einem einzelnen und hochgradig polymorphen S-Locuskontrolliert wird, der mehrere Alleleenthält 6. Der S-Locus enthält zwei Gene, die für eine im Stempel exprimierte Ribonuklease(S-RNase)und ein im Pollenkorn exprimiertes F-Box-Protein (SFB)kodieren 7. In der Selbstinkompatibilitätsreaktion, wenn das im Pollenkorn (haploid) exprimierte S-Allel mit einem der beiden im Stempel (diploid) exprimierten ist, wird das Wachstum des Pollenrohrs über den Stil aufgrund des Abbaus der Pollenröhren-RNA durch die Wirkung der S-RNase8gestoppt. Da dieser Prozess die Befruchtung des weiblichen Gametophyten in der Eizelle verhindert, fördert GSI die Auskreuzung zwischen den Sorten.
Obwohl einige japanische Pflaumensorten selbstkompatibel sind, sind die meisten derzeit angebauten Sorten selbstinkompatibel und benötigen Pollen von interkompatiblen Spendern, um ihre Blüten zu düngen3. Bei Steinobstarten der Gattung Prunus wie Mandel9,Aprikose10,11,12 und Süßkirsche13können die Bestäubungsanforderungen von Sorten durch verschiedene Ansätze festgestellt werden. Die Selbst(in)kompatibilität kann durch Selbstbestäubung von Blüten im Feld und anschließende Überwachung des Fruchtansatzes oder durch semi-in vivo Selbstbestäubungen unter kontrollierten Bedingungen in einem Labor und die Beobachtung von Pollenröhrchen unter dem Mikroskop bestimmt werden14,15,16,17,18 . Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen Sorten können durch Kreuzbestäubungen im Feld oder im Labor unter Verwendung von Pollen der potenziellen Bestäubersorte und durch die Identifizierung von S-Allelenjeder Sorte durch PCR-Analyse bestimmt werden14,15,16,19,20,21,22 . Bei Arten wie Süßkirsche oder Mandel kann die Selbstverträglichkeit auch durch die Identifizierung bestimmter S-Allele beurteilt werden, die mit der Selbstkompatibilität assoziiert sind, wie S4‘ in Süßkirsche13 oder Sf in Mandel23.
Mehrere Pflaumenzuchtprogramme aus den wichtigsten Erzeugerländern setzen eine Reihe neuer Sorten2,14frei, von denen viele unbekannte Bestäubungsanforderungen haben. In dieser Arbeit wird eine Methodik zur Bestimmung des Bestäubungsbedarfs in japanischen Pflaumen-Hybriden beschrieben. Die Selbst(in)Verträglichkeit wird durch Selbstbestäubungen sowohl im Feld als auch im Labor bestimmt, gefolgt von Beobachtungen von Pollenröhren unter der Fluoreszenzmikroskopie. Die Selektion von Bestäubersorten kombiniert die Identifizierung von S-Genotypen durch PCR-Analyse mit der Überwachung der Blütezeit im Feld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hierin beschriebene Methodik für den Bestäubungsbedarf japanischer Pflaumensorten erfordert die Bestimmung der Selbst-(Un-)Kompatibilität jeder Sorte durch kontrollierte Bestäubungen im Feld oder im Labor und die anschließende Beobachtung des Pollenröhrenwachstums mit Fluoreszenzmikroskopie. Die Inkompatibilitätsbeziehungen werden durch die Charakterisierung der S-Allele durch molekulare Genotypisierung hergestellt. Schließlich wird die Auswahl der Bestäuber von der Überwachungsphänologie durchgef…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde vom Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 und RTA2017-00003-00) finanziert. Gobierno de Aragón – Europäischer Sozialfonds, Europäische Union (Grupo Consolidado A12-17R) und Junta de Extremadura – Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero wurde durch ein Stipendium des Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología von Mexiko (CONACYT, 471839) unterstützt.
Materials
| Acetic Acid Glacial | Panreac | 131008.1611 | |
| Agar | iNtRON Biotechnology | 25999 | |
| Aniline blue | Difco | 8504-88 | |
| Boric Acid (H3BO4) | Panreac | 131015.1210 | |
| Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) | Panreac | 131231.1211 | |
| Coverglass | Deltalab | D102460 | 24 mm x 60 mm |
| Digital Camera | Imaging Developmet Systems | UI-1490SE | |
| Digital Camera Software Suite | Imaging Developmet Systems | 4.93.0. | |
| DNA Oligos | ThermoFisher Scientific | ||
| dNTP Mix, 10 mM each | ThermoSischer Scientific | R0193 | |
| DreamTaq Green DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | EP0713 | |
| Ethanol 96° | VWR-Chemicals | 83804.360 | |
| 1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) | Invitrogen | 15615-016 | Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | 1708195 | |
| Hand Counter | Tamaco | TM-4 | |
| Image Lab Software | Bio-Rad | Image Analyse System for Gel Documentation System | |
| MetaPhor Agarose | Lonza | 50180 | |
| Microcentrifuge 5415 R | Eppendorf | Z605212 | |
| Microscope with UV epiflurescence | Leica | DM2500 | Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425 |
| Microslides | Deltalab | D100004 | 26 mm x 76 mm |
| Mini Electrophoresis System | Fisherbrand | 14955170 | |
| Minicentrifuge | ThermoFisher Scientific | 15334204 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND1000 | |
| Petri Dishes | Deltalab | 200201 | 55 mm x 14 mm |
| Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) | Panreac | 141513 | |
| Primer forward 'Pru C2' | ThermoFisher Scientific | ||
| Primer forward Pru T2' | ThermoFisher Scientific | ||
| Primer reverse 'PCER' | ThermoFisher Scientific | ||
| RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | iNtRON Biotechnology | 21141 | |
| Saccharose | Panreac | 131621.1211 | |
| Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) | Panreac | 131717.1211 | |
| Speedtools plant DNA extraction Kit | Biotools | 21272 | |
| TBE Buffer (10X) | Panreac | A0972,5000PE | |
| Thermal Cycler T100 | Bio-Rad | 1861096 | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | T1317 | |
| Vertical Autoclave Presoclave II | JP Selecta | 4001725 | |
| Vortex | Fisherbrand | 11746744 |
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