JoVE Journal > Developmental Biology
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Abstract
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Biologie du développement

현상학 모니터링, 손 오염, 형광 현미경 검사법 및 분자 지노티핑에 의한 일본 매화의 수분 요구 사항 수립

Published: November 09, 2020
doi:
10.3791/61897
, ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza),Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX),Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

Summary

일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있는데, 이는 형광 현미경검사법에 따른 꽃가루 관의 현장 및 실험실 오염물질 및 관찰과 PCR에 의한 S-유전자형 식별 및 수분제 선택을 위한 꽃의 모니터링을 결합한 것입니다.

Abstract

일반적으로 재배되는 일본 매실 품종은 원래 프룬누스 살리시나와 다른 프룬스 종 사이의 십자가에서 파생된 상호 특이적 하이브리드입니다. 대부분의 하이브리드는 여러 개의 알렐을 포함하는 단일 및 고다형성 S-메큐에 의해 제어되는 게임토피틱 자체 비호환성을 나타낸다. 대부분의 재배 하이브리드는 자체 호환되지 않으며 꽃을 비옥하게하기 위해 호환 되는 기증자의 꽃가루가 필요합니다. 일본 매화의 수분 요건을 확립하는 것은 알려지지 않은 수분 요건을 가진 새로운 품종의 수가 많기 때문에 점점 더 중요해지고 있습니다. 이 작품에서는 일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있다. 자가(in)호환성은 분야와 실험실 모두에서 수작업 오염에 의해 결정되며, 그 다음으로 형광 현미경으로 꽃가루 튜브 신장을 모니터링하고 현장에서 과일 성숙을 모니터링합니다. 수분화 품종의 선택은 PCR 분석에 의한 S-유전자형의 식별과 현장에서의 개화 시간 모니터링을 결합하여 평가된다. 품종의 수분 요구 사항을 알면 새로운 과수원 설계를 위한 품종 의 선택이 가능하고 확립된 과수원의 수분 결핍과 관련된 생산성 문제를 조기에 감지할 수 있습니다.

Introduction

일본 매화(프룬스 살리시나 린들)는 중국1이원산지입니다. 19세기에 일본에서 미국으로 이 작물이 도입되어 다른 북미 디플로이드 자두2와교차했습니다. 20세기에, 이러한 하이브리드의 일부는 전 세계 온대 지역으로 확산되었다. 요즘에는 “일본 매실”이라는 용어는 원래 P. 살리시나 사이의 십자가에서 파생된 광범위한 상호 특이적 하이브리드를 말하며, 최대 15개의 다른 디플리드 Prunus spp.3,4,5.

일본 매화는 Rosaceae 가족의 다른 종과 마찬가지로 여러알렐을포함하는 단일 및 고다형성 S-메큐에 의해 제어되는 게임토피틱 자기 비호환성(GSI)을 전시합니다. S-메뚜기는 피스틸로 발현된 리보누클레스(S-RNase)와 꽃가루 곡물7에서발현된 F박스 단백질(SFB)을 인코딩하는 두 개의 유전자를 함유하고 있다. 자가비호환성 반응에서, 꽃가루 곡물(haploid)으로 발현된 S-allele이 피슬틸(diploid)에 발현된 두 가지 중 하나와 동일할 때, 스타일 전반에 걸친 꽃가루 관RNA의 성장은 S-RNase8의작용에 의해 꽃가루 관 RNA의 저하로 인해 체포된다. 이 과정은 배란에서 여성 게임 토피의 수정을 방지하기 때문에, GSI는 품종 사이의 횡단을 촉진.

일부 일본 매실 품종은 자기 호환이지만, 현재 재배 된 대부분의 품종은 자기 호환되지 않으며, 자신의 꽃을 수정하기 위해 호환 되는 기증자의 꽃가루가 필요합니다3. 아몬드9,살구10,11,12 및 달콤한 체리13과같은 프루누스 속의 돌 과일 종에서는 품종의 수분 요구 사항을 다른 접근법에 의해 확립 할 수 있습니다. 자가(in)호환성은 현장에서 꽃의 자가 수분및 과일 세트의 후속 모니터링에 의해 결정될 수 있으며, 또는 실험실에서 제어된 조건에서 반 생체 자체 질립및 현미경14,15,16,17,18의 꽃가루 튜브 관찰에 의해 결정될 수있다. . 품종 간의 비호환성 관계는 잠재적 인 수분화 품종의 꽃가루를 사용하여 필드 또는 실험실에서 교차 오염에 의해 결정될 수 있으며, PCR 분석에 의해 각 품종의 S-alleles의 식별에 의해 결정될 수있다14,15,16,20,21,22 . 달콤한 체리 나 아몬드와 같은 종에서, 자체 (in)호환성은 또한 아몬드23에서달콤한 체리13 또는 Sf에서 S4‘로 자기 호환성에 관련된 특정 S 알레일의 식별에 의해 평가 될 수있다.

주요 생산국의 여러 매실 사육 프로그램은 알 수없는 수분 요구 사항을 가진 새로운 품종2,14의숫자를 발표하고 있습니다. 이 작품에서는 일본 매화형 하이브리드의 수분 요건 을 결정하는 방법론이 설명되어 있다. 자기(in)호환성은 분야와 실험실 모두에서 자체 오염에 의해 결정되며, 그 다음에형광 현미경 검사의 꽃가루 튜브를 관찰합니다. 수분화 품종의 선택은 현장에서 꽃 시간의 모니터링과 PCR 분석에 의한 S-유전자형의 식별을 결합합니다.

Protocol

1. 현장에서 수분 수분 꽃가루 추출 BBCH 스케일25,26의스테이지 57에 따르면 꽃가루를 얻으려면 스테이지 D24에서꽃봉오리를 수집하십시오.참고: 다른 가지각선 종보다 일본 매화에서는 꽃봉오리가 더 적게 생산되기 때문에 꽃봉오리가 더 많이 필요합니다. 플라스틱 메쉬(2mm x 2mm 모공 크기)?…

Representative Results

일본의 매화 꽃봉오리에는 1~3개의 꽃이 들어있는 꽃이 들어 있습니다. 다른 돌 과일 종에서와 마찬가지로, 각 꽃은 네 개의 소용돌이로 구성되어 있습니다 : 카펠, stamens, 꽃잎, 그리고 꽃의 기지에서 컵을 형성하는 융합되는 세팔. 꽃 구조는 다른 돌 과일보다 작으며, 소량의 꽃가루 곡물을 포함하는 stamens로 둘러싸인 짧고 깨지기 쉬운 피질이 있습니다. 만개시, 각 꽃의 꽃은 짧은 줄기에 분리 된 ?…

Discussion

본원에 설명된 방법론은 일본 매실 품종의 수분 요건을 위해 필드 또는 실험실에서 제어된 오염물질에 의한 각 품종의 자체(in) 호환성을 결정하고, 형광 현미경으로 꽃가루 튜브 성장의 후속 관찰을 요구한다. 비호환성 관계는 분자 지노티핑에 의한 S-alleles의 특성화에 의해 확립된다. 마지막으로, 수분 제의 선택은 매년 꽃에서 일치하는 그 품종을 검출하기 위해 모니터링 phenology에 의해 ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y 알리멘타리아 (RFP2015-00015-00 및 RTA2017-00003-00);에 의해 투자되었습니다. 고비에르노 데 아라곤-유럽 사회 기금, 유럽 연합 (그루포 콘솔리다 A12-17R), 그리고 준타 드 엑스트레마두라 —폰도 유럽오 데 데사롤로 지역 (FEDER), 계획 지역 드 Investigación (IB16181), 그루포 드 Investigación (AGA001, GR1819). B.I. 게레로는 멕시코의 콘세조 나시오날 드 시엔시아 이 Tecnología (CONACYT, 471839)의 펠로우십에 의해 지원되었다.

Materials

Acetic Acid Glacial Panreac 131008.1611
Agar iNtRON Biotechnology 25999
Aniline blue Difco 8504-88
Boric Acid (H3BO4) Panreac 131015.1210
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) Panreac 131231.1211
Coverglass Deltalab D102460 24 mm x 60 mm
Digital Camera Imaging Developmet Systems UI-1490SE
Digital Camera Software Suite Imaging Developmet Systems 4.93.0.
DNA Oligos ThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM each ThermoSischer Scientific R0193
DreamTaq Green DNA polymerase ThermoFisher Scientific EP0713
Ethanol 96° VWR-Chemicals 83804.360
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) Invitrogen 15615-016 Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl
Gel Documentation System Bio-Rad 1708195
Hand Counter Tamaco TM-4
Image Lab Software Bio-Rad Image Analyse System for Gel Documentation System
MetaPhor Agarose Lonza 50180
Microcentrifuge 5415 R Eppendorf Z605212
Microscope with UV epiflurescence Leica DM2500 Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425
Microslides Deltalab D100004 26 mm x 76 mm
Mini Electrophoresis System Fisherbrand 14955170
Minicentrifuge ThermoFisher Scientific 15334204
NanoDrop 1000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND1000
Petri Dishes Deltalab 200201 55 mm x 14 mm
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) Panreac 141513
Primer forward 'Pru C2' ThermoFisher Scientific
Primer forward Pru T2' ThermoFisher Scientific
Primer reverse 'PCER' ThermoFisher Scientific
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution iNtRON Biotechnology 21141
Saccharose Panreac 131621.1211
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) Panreac 131717.1211
Speedtools plant DNA extraction Kit Biotools 21272
TBE Buffer (10X) Panreac A0972,5000PE
Thermal Cycler T100 Bio-Rad 1861096
Thermomixer comfort Eppendorf T1317
Vertical Autoclave Presoclave II JP Selecta 4001725
Vortex Fisherbrand 11746744
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References

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Pollination RequirementsJapanese PlumPhenological MonitoringHand PollinationsFluorescence MicroscopyMolecular GenotypingSelf-incompatible CultivarsPollen ExtractionBBCH ScaleFruit SetSelf-pollinationCross-pollinationPollen GerminationFixative SolutionMicroscopy
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Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping. J. Vis. Exp. (165), e61897, doi:10.3791/61897 (2020).
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