Descreve-se uma metodologia para a determinação dos requisitos de polinização em híbridos do tipo ameixa japonês, que combina polinizações de campo e laboratório e observações de tubos de pólen sob a microscopia de fluorescência com a identificação de S-genótipos pela PCR e o monitoramento da floração para a seleção de polinizadores.
As cultivares japonesas de ameixa comumente cultivadas são híbridos interespecíficos derivados de cruzes entre a salicina prunus original com outras espécies de Prunus. A maioria dos híbridos exibe autoincompatibilidade gametofítica, que é controlada por um único e altamente polimórfico S-locus que contém vários alelos. A maioria dos híbridos cultivados são auto-incompatíveis e precisam de pólen de um doador compatível para fertilizar suas flores. O estabelecimento de requisitos de polinização na ameixa japonesa está se tornando cada vez mais importante devido ao alto número de novas cultivares com requisitos desconhecidos de polinização. Neste trabalho, descreve-se uma metodologia para a determinação dos requisitos de polinização em híbridos do tipo ameixa japonês. A auto-(in)compatibilidade é determinada por polinizações manuais tanto no campo quanto no laboratório, seguida pelo monitoramento do alongamento do tubo de pólen com microscopia de fluorescência, e também pelo monitoramento da maturação da fruta no campo. A seleção de cultivares polinizadores é avaliada pela combinação da identificação de S-genótipos pela análise pcr com o monitoramento do tempo de floração no campo. Conhecer os requisitos de polinização das cultivares facilita a seleção de cultivares para a concepção de novos pomares e permite a detecção precoce de problemas de produtividade relacionados à deficiência de polinização em pomares estabelecidos.
A ameixa japonesa(Prunus salicina Lindl.) é nativa da China1. No séculoXIX, esta cultura foi introduzida do Japão para os Estados Unidos, onde foi intercalada com outras ameixas diploides norte-americanas2. No séculoXX, alguns desses híbridos foram espalhados para regiões temperadas ao redor do mundo. Atualmente, o termo “ameixa japonesa” refere-se a uma ampla gama de híbridos interespecíficos derivados de cruzes entre a Salicina P. original com até 15 outros diploides Prunus spp.3,4,5.
A ameixa japonesa, como outras espécies da família Rosaceae, exibe a Autoincompatibilidade Gametofitica (GSI), que é controlada por um único e altamente polimórfico S-locuscontendo múltiplos alelos6. O S-locus contém dois genes que codificam uma ribonuclease (S-RNase) expressa no pistil, e uma proteína F-box (SFB) expressa no grão de pólen7. Na reação de autoincompatibilidade, quando o alelo Sexpresso no grão de pólen (haploide) é o mesmo que um dos dois expressos no pistil (diploide), o crescimento do tubo de pólen em todo o estilo é preso devido à degradação do tubo de pólen RNA pela ação do S-RNase8. Uma vez que esse processo impede a fertilização do gametofito feminino no ovulo, o GSI promove o cruzamento entre cultivares.
Embora algumas cultivares japonesas de ameixa sejam autocompatíveis, a maioria das cultivares cultivadas atualmente são auto-incompatíveis, e precisam de pólen de doadores intercompatíveis para fertilizar suas flores3. Em espécies de frutas de pedra do gênero Prunus como amêndoa9, damasco10,11,12 e cereja doce13, os requisitos de polinização de cultivares podem ser estabelecidos por diferentes abordagens. A auto-(in)compatibilidade pode ser determinada pela auto-polinização das flores no campo e monitoramento subsequente do conjunto de frutas, ou por auto-polinizações semi-in vivo em condições controladas em laboratório e pela observação de tubos de pólen sob o microscópio14,15,16,17,18 . As relações de incompatibilidade entre as cultivares podem ser determinadas por polinizações cruzadas no campo ou no laboratório utilizando pólen da cultivar polinizadora potencial, e pela identificação de S-alelosde cada cultivar pela análise PCR14,15,16,19,20,21,22 . Em espécies como cereja doce ou amêndoa, a auto-(in)compatibilidade também pode ser avaliada pela identificação de alelos S específicos associados à auto-compatibilidade, como S4‘ na cereja doce13 ou Sf na amêndoa23.
Vários programas de criação de ameixas dos principais países produtores estão liberando uma série de novas cultivares2,14, muitas delas com requisitos desconhecidos de polinização. Neste trabalho, descreve-se uma metodologia para a determinação dos requisitos de polinização em híbridos do tipo ameixa japonês. A auto-(in)compatibilidade é determinada por auto-polinizações tanto no campo quanto no laboratório, seguida por observações de tubos de pólen sob a microscopia de fluorescência. A seleção de cultivares polinizadores combina a identificação de S-genótipos pela análise pcr com o monitoramento do tempo de floração no campo.
A metodologia aqui descrita para os requisitos de polinização das cultivares japonesas de ameixa requer determinar a auto-(in)compatibilidade de cada cultivar por polinizações controladas no campo ou no laboratório, e a observação subsequente do crescimento do tubo de pólen com microscopia de fluorescência. As relações de incompatibilidade são estabelecidas pela caracterização dos S-alelos por genotipagem molecular. Por fim, a seleção de polinizadores é realizada pela fenoologia de monitoramento…
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional de Investigação y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 e RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón — Fundo Social Europeu, União Europeia (Grupo Consolidado A12-17R) e Junta de Extremadura — Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plano Regional de Investigação (IB16181), Grupo de Investigação (AGA001, GR18196). O B.I. Guerrero foi apoiado por uma bolsa do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología do México (CONACYT, 471839).
Acetic Acid Glacial | Panreac | 131008.1611 | |
Agar | iNtRON Biotechnology | 25999 | |
Aniline blue | Difco | 8504-88 | |
Boric Acid (H3BO4) | Panreac | 131015.1210 | |
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) | Panreac | 131231.1211 | |
Coverglass | Deltalab | D102460 | 24 mm x 60 mm |
Digital Camera | Imaging Developmet Systems | UI-1490SE | |
Digital Camera Software Suite | Imaging Developmet Systems | 4.93.0. | |
DNA Oligos | ThermoFisher Scientific | ||
dNTP Mix, 10 mM each | ThermoSischer Scientific | R0193 | |
DreamTaq Green DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | EP0713 | |
Ethanol 96° | VWR-Chemicals | 83804.360 | |
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) | Invitrogen | 15615-016 | Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl |
Gel Documentation System | Bio-Rad | 1708195 | |
Hand Counter | Tamaco | TM-4 | |
Image Lab Software | Bio-Rad | Image Analyse System for Gel Documentation System | |
MetaPhor Agarose | Lonza | 50180 | |
Microcentrifuge 5415 R | Eppendorf | Z605212 | |
Microscope with UV epiflurescence | Leica | DM2500 | Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425 |
Microslides | Deltalab | D100004 | 26 mm x 76 mm |
Mini Electrophoresis System | Fisherbrand | 14955170 | |
Minicentrifuge | ThermoFisher Scientific | 15334204 | |
NanoDrop 1000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND1000 | |
Petri Dishes | Deltalab | 200201 | 55 mm x 14 mm |
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) | Panreac | 141513 | |
Primer forward 'Pru C2' | ThermoFisher Scientific | ||
Primer forward Pru T2' | ThermoFisher Scientific | ||
Primer reverse 'PCER' | ThermoFisher Scientific | ||
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | iNtRON Biotechnology | 21141 | |
Saccharose | Panreac | 131621.1211 | |
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) | Panreac | 131717.1211 | |
Speedtools plant DNA extraction Kit | Biotools | 21272 | |
TBE Buffer (10X) | Panreac | A0972,5000PE | |
Thermal Cycler T100 | Bio-Rad | 1861096 | |
Thermomixer comfort | Eppendorf | T1317 | |
Vertical Autoclave Presoclave II | JP Selecta | 4001725 | |
Vortex | Fisherbrand | 11746744 |