JoVE Journal > Developmental Biology
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Biologie du développement

Estabelecendo requisitos de polinização em ameixa japonesa por monitoramento fenológico, polinizações manuais, Microscopia de Fluorescência e Genotipagem Molecular

Published: November 09, 2020
doi:
10.3791/61897
, ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza),Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX),Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

Summary

Descreve-se uma metodologia para a determinação dos requisitos de polinização em híbridos do tipo ameixa japonês, que combina polinizações de campo e laboratório e observações de tubos de pólen sob a microscopia de fluorescência com a identificação de S-genótipos pela PCR e o monitoramento da floração para a seleção de polinizadores.

Abstract

As cultivares japonesas de ameixa comumente cultivadas são híbridos interespecíficos derivados de cruzes entre a salicina prunus original com outras espécies de Prunus. A maioria dos híbridos exibe autoincompatibilidade gametofítica, que é controlada por um único e altamente polimórfico S-locus que contém vários alelos. A maioria dos híbridos cultivados são auto-incompatíveis e precisam de pólen de um doador compatível para fertilizar suas flores. O estabelecimento de requisitos de polinização na ameixa japonesa está se tornando cada vez mais importante devido ao alto número de novas cultivares com requisitos desconhecidos de polinização. Neste trabalho, descreve-se uma metodologia para a determinação dos requisitos de polinização em híbridos do tipo ameixa japonês. A auto-(in)compatibilidade é determinada por polinizações manuais tanto no campo quanto no laboratório, seguida pelo monitoramento do alongamento do tubo de pólen com microscopia de fluorescência, e também pelo monitoramento da maturação da fruta no campo. A seleção de cultivares polinizadores é avaliada pela combinação da identificação de S-genótipos pela análise pcr com o monitoramento do tempo de floração no campo. Conhecer os requisitos de polinização das cultivares facilita a seleção de cultivares para a concepção de novos pomares e permite a detecção precoce de problemas de produtividade relacionados à deficiência de polinização em pomares estabelecidos.

Introduction

A ameixa japonesa(Prunus salicina Lindl.) é nativa da China1. No séculoXIX, esta cultura foi introduzida do Japão para os Estados Unidos, onde foi intercalada com outras ameixas diploides norte-americanas2. No séculoXX, alguns desses híbridos foram espalhados para regiões temperadas ao redor do mundo. Atualmente, o termo “ameixa japonesa” refere-se a uma ampla gama de híbridos interespecíficos derivados de cruzes entre a Salicina P. original com até 15 outros diploides Prunus spp.3,4,5.

A ameixa japonesa, como outras espécies da família Rosaceae, exibe a Autoincompatibilidade Gametofitica (GSI), que é controlada por um único e altamente polimórfico S-locuscontendo múltiplos alelos6. O S-locus contém dois genes que codificam uma ribonuclease (S-RNase) expressa no pistil, e uma proteína F-box (SFB) expressa no grão de pólen7. Na reação de autoincompatibilidade, quando o alelo Sexpresso no grão de pólen (haploide) é o mesmo que um dos dois expressos no pistil (diploide), o crescimento do tubo de pólen em todo o estilo é preso devido à degradação do tubo de pólen RNA pela ação do S-RNase8. Uma vez que esse processo impede a fertilização do gametofito feminino no ovulo, o GSI promove o cruzamento entre cultivares.

Embora algumas cultivares japonesas de ameixa sejam autocompatíveis, a maioria das cultivares cultivadas atualmente são auto-incompatíveis, e precisam de pólen de doadores intercompatíveis para fertilizar suas flores3. Em espécies de frutas de pedra do gênero Prunus como amêndoa9, damasco10,11,12 e cereja doce13, os requisitos de polinização de cultivares podem ser estabelecidos por diferentes abordagens. A auto-(in)compatibilidade pode ser determinada pela auto-polinização das flores no campo e monitoramento subsequente do conjunto de frutas, ou por auto-polinizações semi-in vivo em condições controladas em laboratório e pela observação de tubos de pólen sob o microscópio14,15,16,17,18 . As relações de incompatibilidade entre as cultivares podem ser determinadas por polinizações cruzadas no campo ou no laboratório utilizando pólen da cultivar polinizadora potencial, e pela identificação de S-alelosde cada cultivar pela análise PCR14,15,16,19,20,21,22 . Em espécies como cereja doce ou amêndoa, a auto-(in)compatibilidade também pode ser avaliada pela identificação de alelos S específicos associados à auto-compatibilidade, como S4‘ na cereja doce13 ou Sf na amêndoa23.

Vários programas de criação de ameixas dos principais países produtores estão liberando uma série de novas cultivares2,14, muitas delas com requisitos desconhecidos de polinização. Neste trabalho, descreve-se uma metodologia para a determinação dos requisitos de polinização em híbridos do tipo ameixa japonês. A auto-(in)compatibilidade é determinada por auto-polinizações tanto no campo quanto no laboratório, seguida por observações de tubos de pólen sob a microscopia de fluorescência. A seleção de cultivares polinizadores combina a identificação de S-genótipos pela análise pcr com o monitoramento do tempo de floração no campo.

Protocol

1. Polinização manual no campo Extração de pólen Para obter pólen, colete botões de flores no estágio D24,de acordo com o estágio 57 na escalaBBCH 25,26.NOTA: Mais botões de flores são necessários na ameixa japonesa do que em outras espécies de Prunus porque seus anteros produzem menos pólen. Retire os anteás usando uma malha plástica (tamanho de poros de 2 mm x …

Representative Results

Cada broto de flor de ameixa japonês contém uma inflorescência com 1-3 flores. Como em outras espécies de frutas de pedra, cada flor é composta de quatro prostitutas: carpel, estamens, pétalas e sepalas, que são fundidas formando um copo na base da flor. As estruturas florais são menores do que outras frutas de pedra, com um mitil curto e frágil cercado pelos estamens que contêm uma pequena quantidade de grãos de pólen. Em plena floração, as flores de cada inflorescência aparecem separadas em talos curtos,…

Discussion

A metodologia aqui descrita para os requisitos de polinização das cultivares japonesas de ameixa requer determinar a auto-(in)compatibilidade de cada cultivar por polinizações controladas no campo ou no laboratório, e a observação subsequente do crescimento do tubo de pólen com microscopia de fluorescência. As relações de incompatibilidade são estabelecidas pela caracterização dos S-alelos por genotipagem molecular. Por fim, a seleção de polinizadores é realizada pela fenoologia de monitoramento…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional de Investigação y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 e RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón — Fundo Social Europeu, União Europeia (Grupo Consolidado A12-17R) e Junta de Extremadura — Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plano Regional de Investigação (IB16181), Grupo de Investigação (AGA001, GR18196). O B.I. Guerrero foi apoiado por uma bolsa do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología do México (CONACYT, 471839).

Materials

Acetic Acid Glacial Panreac 131008.1611
Agar iNtRON Biotechnology 25999
Aniline blue Difco 8504-88
Boric Acid (H3BO4) Panreac 131015.1210
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) Panreac 131231.1211
Coverglass Deltalab D102460 24 mm x 60 mm
Digital Camera Imaging Developmet Systems UI-1490SE
Digital Camera Software Suite Imaging Developmet Systems 4.93.0.
DNA Oligos ThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM each ThermoSischer Scientific R0193
DreamTaq Green DNA polymerase ThermoFisher Scientific EP0713
Ethanol 96° VWR-Chemicals 83804.360
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) Invitrogen 15615-016 Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl
Gel Documentation System Bio-Rad 1708195
Hand Counter Tamaco TM-4
Image Lab Software Bio-Rad Image Analyse System for Gel Documentation System
MetaPhor Agarose Lonza 50180
Microcentrifuge 5415 R Eppendorf Z605212
Microscope with UV epiflurescence Leica DM2500 Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425
Microslides Deltalab D100004 26 mm x 76 mm
Mini Electrophoresis System Fisherbrand 14955170
Minicentrifuge ThermoFisher Scientific 15334204
NanoDrop 1000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND1000
Petri Dishes Deltalab 200201 55 mm x 14 mm
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) Panreac 141513
Primer forward 'Pru C2' ThermoFisher Scientific
Primer forward Pru T2' ThermoFisher Scientific
Primer reverse 'PCER' ThermoFisher Scientific
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution iNtRON Biotechnology 21141
Saccharose Panreac 131621.1211
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) Panreac 131717.1211
Speedtools plant DNA extraction Kit Biotools 21272
TBE Buffer (10X) Panreac A0972,5000PE
Thermal Cycler T100 Bio-Rad 1861096
Thermomixer comfort Eppendorf T1317
Vertical Autoclave Presoclave II JP Selecta 4001725
Vortex Fisherbrand 11746744
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References

  1. Hendrick, U. P. . The Plums of New York. , (1911).
  2. Okie, W. R., Hancock, J. F., Hancock, J. F. Plums. Temperate Fruit Crop Breeding. , 337-357 (2008).
  3. Guerra, M. E., Rodrigo, J. Japanese plum pollination: a review. Scientia Horticulturae. 197, 674-686 (2015).
  4. Okie, W. R. Introgression of Prunus species in plum. New York Fruit Quarterly. 14 (1), 29-37 (2006).
  5. Okie, W. R., Weinberger, J. H., Janick, J., Moore, J. . Fruit Breeding, vol. 1. Tree and tropical fruits. , 559-608 (1996).
  6. Mccubbin, A. G., Kao, T. Molecular recognition and response in pollen and pistil interactions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 333-364 (2000).
  7. Hegedűs, A., Halász, J. Recent findings of the tree fruit self-incompatibility studies. International Journal of Horticultural Science. 13 (2), 7-15 (2007).
  8. de Nettancourt, D. . Incompatibility and Incongruity in Wild and Cultivated Plants. , (2001).
  9. Tao, R., et al. Identification of stylar RNases associated with gametophytic self-incompatibility in almond (Prunus dulcis). Plant and Cell Physiology. 38 (3), 304-311 (1997).
  10. Halász, J., Pedryc, A., Ercisli, S., Yilmaz, K., Hegedűs, A. S-genotyping supports the genetic relationships between Turkish and Hungarian apricot germplasm. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (5), 410-417 (2010).
  11. Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Self-incompatibility and S-allele identification in new apricot cultivars. Acta Horticulturae. (1231), 171-176 (2019).
  12. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
  13. Cachi, A. M., Wunsch, A. Characterization of self-compatibility in sweet cherry varieties by crossing experiments and molecular genetic analysis. Tree Genetics & Genomes. 10, 1205-1212 (2014).
  14. Guerra, M. E., Guerrero, B. I., Casadomet, C., Rodrigo, J. Self-compatibility, S-RNase allele identification, and selection of pollinizers in new Japanese plum-type cultivars. Scientia Horticulturae. 261, 109022 (2020).
  15. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 1-12 (2018).
  16. Herrera, S., Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Lora, J. Identification of self-incompatibility alleles by specific PCR analysis and S-RNase sequencing in apricot. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3612 (2018).
  17. Sociasi Company, R., Kodad, O., Fernández i Martí, J. M., Alonso, J. M. Mutations conferring self-compatibility in Prunus species: from deletions and insertions to epigenetic alterations. Scientia Horticulturae. 192, 125-131 (2015).
  18. Rodrigo, J., Herrero, M. Evaluation of pollination as the cause of erratic fruit set in apricot ‘Moniqui. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 71 (5), 801-805 (1996).
  19. Beppu, K., et al. Se-haplotype confers self-compatibility in Japanese plum (Prunus salicina Lindl). Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 80 (6), 760-764 (2005).
  20. Guerra, M. E., Rodrigo, J., López-Corrales, M., Wünsch, A. S-RNase genotyping and incompatibility group assignment by PCR and pollination experiments in Japanese plum. Plant Breeding. 128 (3), 304-311 (2009).
  21. Guerra, M. E., Wunsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Flower emasculation as the cause for lack of fruit set in Japanese plum crosses. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (6), 556-562 (2010).
  22. Guerra, M. E., Wünsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Lack of fruit set caused by ovule degeneration in Japanese plum. Journal of the American Society for Horticultural Science. 136 (6), 375-381 (2011).
  23. Fernández i Martí, A., Gradziel, T. M., Socias i Company, R. Methylation of the Sf locus in almond is associated with S-RNase loss of function. Plant Molecular Biology. 86, 681-689 (2014).
  24. Baggiolini, M. Les stades repérés des arbres fruitiers à noyau. Revue romande d’Agriculture et d’Arboriculture. 8, 3-4 (1952).
  25. Meier, U. Growth stages of mono-and dicotyledonous plants: BBCH Monograph. Federal Biological Research Centre for Agriculture and Forestry. , (2001).
  26. Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Flower development in sweet cherry framed in the BBCH scale. Scientia Horticulturae. 192, 141-147 (2015).
  27. Fadon, E., Rodrigo, J. Combining histochemical staining and image analysis to quantify starch in the ovary primordia of sweet cherry during winter dormancy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
  28. Hormaza, J. I., Pinney, K., Polito, V. S. Correlation in the tolerance to ozone between sporophytes and male gametophytes of several fruit and nut tree species (Rosaceae). Sexual Plant Reproduction. 9, 44-48 (1996).
  29. Burgos, L., et al. The self-compatibility trait of the main apricot cultivars and new selections from breeding programmes. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 72 (1), 147-154 (1997).
  30. Dicenta, F., Ortega, E., Cánovas, J. A., Egea, J. Self-pollination vs. cross-pollination in almond: pollen tube growth, fruit set and fruit characteristics. Plant Breeding. 121, 163-167 (2002).
  31. Alonso, J. M., Socias i Company, R. Differential pollen tube growth in inbred self-compatible almond genotypes. Euphytica. 144, 207-213 (2005).
  32. Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. The effect of temperature on pollen germination, pollen tube growth, and stigmatic receptivity in peach. Plant Biology. 7, 476-483 (2005).
  33. Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. Warm temperatures at bloom reduce fruit set in sweet cherry. Journal of Applied Botany. 81, 158-164 (2007).
  34. Milatović, D., Nikolić, D. Analysis of self-(in)compatibility in apricot cultivars using fluorescence microscopy. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 82, 170-174 (2007).
  35. Jia, H. J., He, F. J., Xiong, C. Z., Zhu, F. R., Okamoto, G. Influences of cross pollination on pollen tube growth and fruit set in Zuili plums (Prunus salicina). Journal of Integrative Plant Biology. 50, 203-209 (2008).
  36. Herrero, M., Salvador, J. La polinización del ciruelo Red Beaut. Información Técnica Econónomica Agraria. 41, 3-7 (1980).
  37. Ramming, D. W. Plum. Register of new fruit and nut varieties: Brooks and Olmo, List 37. HortScience. 30 (6), 1142-1144 (1995).
  38. Hartmann, W., Neümuller, M. Plum breeding. Breeding plantation tree crops: Temperate species. , 161-231 (2009).
  39. Guerra, M. E., López-Corrales, M., Wünsch, A. Improved S-genotyping and new incompatibility groups in Japanese plum. Euphytica. 186 (2), 445-452 (2012).
  40. Tao, R., et al. Molecular typing of S-alleles through identification, characterization and cDNA cloning for S-RNases in sweet cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science. 124 (3), 224-233 (1999).
  41. Yamane, H., Tao, R., Sugiura, A., Hauck, N. R., Lezzoni, A. F. Identification and characterization of S-RNases in tetraploid sour cherry (Prunus cerasus). Journal of the American Society for Horticultural Science. 126, 661-667 (2001).
  42. López, M., Jose, F., Vargas, F. J., Battle, I. Self-(in)compatibility almond genotypes: a review. Euphytica. 150, 1-16 (2006).
  43. Bošković, R., Tobutt, K. R. Correlation of stylar ribonuclease zymograms with incompatibility alleles in sweet cherry. Euphytica. 90, 245-250 (1996).
  44. Beppu, K., Syogase, K., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Inheritance of self-compatibility conferred by the Se-haplotype of Japanese plum and development of Se-RNase gene-specific PCR primers. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 85, 215-218 (2010).
  45. Beppu, K., Kumai, M., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Molecular and genetic analyses of the S-haplotype of the self-compatible Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) “Methley”. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 87 (5), 493-498 (2012).
  46. Beppu, K., Konishi, K., Kataoka, I. S-haplotypes and self-compatibility of the Japanese plum cultivar ‘Karari’. Acta Horticulturae. 929, 261-266 (2012).
  47. Sapir, G., Stern, R. A., Shafir, S., Goldway, M. S-RNase based S-genotyping of Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) and its implication on the assortment of cultivar-couples in the orchard. Scientia Horticulturae. 118, 8-13 (2008).
  48. Karp, D. Luther Burbank’s plums. HortScience. 50 (2), 189-194 (2015).

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Citer Cet Article
Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping. J. Vis. Exp. (165), e61897, doi:10.3791/61897 (2020).
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