JoVE Journal > Developmental Biology
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Biologie du développement

Establecimiento de requisitos de polinización en la ciruela japonesa mediante monitoreo fenológico, polinizaciones manuales, microscopía de fluorescencia y genotipado molecular

Published: November 09, 2020
doi:
10.3791/61897
, ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza),Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX),Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

Summary

Se describe una metodología para la determinación de los requisitos de polinización en híbridos japoneses de tipo ciruela, que combina polinizaciones de campo y laboratorio y observaciones de tubos de polen bajo la microscopía de fluorescencia con la identificación de genotipos Spor PCR y el monitoreo de la floración para la selección de polinizadores.

Abstract

Los cultivares de ciruela japonesa comúnmente cultivados son híbridos interespecíficos derivados de cruces entre el Prunus salicina original con otras especies de Prunus. La mayoría de los híbridos exhiben autoincompatibilidad gametofítica, que está controlada por un locus Súnico y altamente polimórfico que contiene múltiples alelos. La mayoría de los híbridos cultivados son autoincompatibles y necesitan polen de un donante compatible para fertilizar sus flores. El establecimiento de requisitos de polinización en la ciruela japonesa es cada vez más importante debido al alto número de nuevos cultivares con requisitos de polinización desconocidos. En este trabajo, se describe una metodología para la determinación de los requisitos de polinización en híbridos japoneses de tipo ciruela. La autocompatibilidad se determina mediante polinizaciones manuales tanto en el campo como en el laboratorio, seguidas de un monitoreo del alargamiento del tubo polínico con microscopía de fluorescencia y también un monitoreo de la maduración de la fruta en el campo. La selección de cultivares polinizadores se evalúa combinando la identificación de genotipos Smediante análisis PCR con el seguimiento del tiempo de floración en campo. Conocer los requerimientos de polinización de los cultivares facilita la selección de cultivares para el diseño de nuevos huertos y permite la detección temprana de problemas de productividad relacionados con la deficiencia de polinización en huertos establecidos.

Introduction

La ciruela japonesa(Prunus salicina Lindl.) es originaria de China1. En elsiglo 19, este cultivo se introdujo desde Japón a los Estados Unidos, donde se cruzó con otras ciruelas diploides de América del Norte2. En elsiglo 20, algunos de estos híbridos se extendieron a regiones templadas de todo el mundo. Hoy en día, el término “ciruela japonesa” se refiere a una amplia gama de híbridos interespecíficos derivados de cruces entre el original P. salicina con hasta otros 15 Prunus diploides spp.3,4,5.

La ciruela japonesa, al igual que otras especies de la familia Rosaceae, exhibe autoincompatibilidad gametofítica (GSI), que está controlada por un locus Súnico y altamente polimórfico que contiene múltiples alelos6. El locus Scontiene dos genes que codifican una ribonucleasa(S-RNasa)expresada en el pistilo, y una proteína F-box (SFB) expresada en el grano de polen7. En la reacción de autoincompatibilidad, cuando el alelo Sexpresado en el grano de polen (haploide) es el mismo que uno de los dos expresados en el pistilo (diploide), el crecimiento del tubo polínico a través del estilo se detiene debido a la degradación del ARN del tubo polen por la acción de la S-RNasa8. Dado que este proceso impide la fertilización del gametofito femenino en el óvulo, GSI promueve el cruce entre cultivares.

Aunque algunos cultivares de ciruela japonesa son autocompatibles, la mayoría de los cultivares que se cultivan actualmente son autoincompatibles y necesitan polen de donantes intercompatibles para fertilizar sus flores3. En las especies de frutas de hueso del género Prunus como la almendra9,el albaricoque10,11,12 y la cereza dulce13,los requisitos de polinización de los cultivares se pueden establecer mediante diferentes enfoques. La auto(in)compatibilidad puede determinarse mediante la autopolinización de flores en el campo y el posterior monitoreo del cuajado de la fruta, o mediante autopolinizacións semi-in vivo en condiciones controladas en un laboratorio y la observación de tubos de polen bajo el microscopio14,15,16,17,18 . Las relaciones de incompatibilidad entre cultivares pueden determinarse mediante polinizaciones cruzadas en el campo o en el laboratorio utilizando polen del cultivar polinizador potencial, y mediante la identificación de alelos Sde cada cultivar mediante análisis de PCR14,15,16,19,20,21,22 . En especies como la cereza dulce o la almendra, la auto(in)compatibilidad también se puede evaluar mediante la identificación de alelos S particulares asociados a la autocompatibilidad, como S4‘ en cereza dulce13 o Sf en almendra23.

Varios programas de mejoramiento de ciruelas de los principales países productores están liberando una serie de nuevos cultivares2,14,muchos de ellos con requisitos de polinización desconocidos. En este trabajo, se describe una metodología para la determinación de los requisitos de polinización en híbridos japoneses de tipo ciruela. La auto(in)compatibilidad está determinada por autopolinizaciones tanto en el campo como en el laboratorio, seguidas de observaciones de tubos de polen bajo la microscopía de fluorescencia. La selección de cultivares polinizadores combina la identificación de genotipos Smediante análisis PCR con el seguimiento del tiempo de floración en campo.

Protocol

1. Polinización manual en el campo Extracción de polen Para obtener polen, recolectar capullos florales en la etapa D24,de acuerdo con la etapa 57 en la escala BBCH25,26.NOTA: Se necesitan más capullos florales en la ciruela japonesa que en otras especies de Prunus porque sus anteras producen menos polen. Retire las anteras con una malla de plástico (tamaño de poro de 2 mm …

Representative Results

Cada capullo de flor de ciruelo japonés contiene una inflorescencia con 1-3 flores. Al igual que en otras especies de frutas de hueso, cada flor se compone de cuatro verticilos: carpelo, estambres, pétalos y sépalos, que se fusionan formando una copa en la base de la flor. Las estructuras florales son más pequeñas que otras frutas de hueso, con un pistilo corto y frágil rodeado por los estambres que contienen una pequeña cantidad de granos de polen. En plena floración, las flores de cada inflorescencia aparecen s…

Discussion

La metodología descrita en este documento para los requisitos de polinización de los cultivares de ciruela japonesa requiere determinar la auto(in)compatibilidad de cada cultivar mediante polinizaciones controladas en el campo o el laboratorio, y la posterior observación del crecimiento del tubo de polen con microscopía de fluorescencia. Las relaciones de incompatibilidad se establecen mediante la caracterización de los alelos Smediante genotipado molecular. Por último, la selección de polinizadores se re…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 y RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón—Fondo Social Europeo, Unión Europea (Grupo Consolidado A12-17R), y Junta de Extremadura —Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero fue apoyado por una beca del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT, 471839).

Materials

Acetic Acid Glacial Panreac 131008.1611
Agar iNtRON Biotechnology 25999
Aniline blue Difco 8504-88
Boric Acid (H3BO4) Panreac 131015.1210
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) Panreac 131231.1211
Coverglass Deltalab D102460 24 mm x 60 mm
Digital Camera Imaging Developmet Systems UI-1490SE
Digital Camera Software Suite Imaging Developmet Systems 4.93.0.
DNA Oligos ThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM each ThermoSischer Scientific R0193
DreamTaq Green DNA polymerase ThermoFisher Scientific EP0713
Ethanol 96° VWR-Chemicals 83804.360
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) Invitrogen 15615-016 Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl
Gel Documentation System Bio-Rad 1708195
Hand Counter Tamaco TM-4
Image Lab Software Bio-Rad Image Analyse System for Gel Documentation System
MetaPhor Agarose Lonza 50180
Microcentrifuge 5415 R Eppendorf Z605212
Microscope with UV epiflurescence Leica DM2500 Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425
Microslides Deltalab D100004 26 mm x 76 mm
Mini Electrophoresis System Fisherbrand 14955170
Minicentrifuge ThermoFisher Scientific 15334204
NanoDrop 1000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND1000
Petri Dishes Deltalab 200201 55 mm x 14 mm
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) Panreac 141513
Primer forward 'Pru C2' ThermoFisher Scientific
Primer forward Pru T2' ThermoFisher Scientific
Primer reverse 'PCER' ThermoFisher Scientific
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution iNtRON Biotechnology 21141
Saccharose Panreac 131621.1211
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) Panreac 131717.1211
Speedtools plant DNA extraction Kit Biotools 21272
TBE Buffer (10X) Panreac A0972,5000PE
Thermal Cycler T100 Bio-Rad 1861096
Thermomixer comfort Eppendorf T1317
Vertical Autoclave Presoclave II JP Selecta 4001725
Vortex Fisherbrand 11746744
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Citer Cet Article
Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping. J. Vis. Exp. (165), e61897, doi:10.3791/61897 (2020).
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