JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie du développement

Fastställande av pollineringskrav i japansk plommon genom fenologisk övervakning, handbestämning, fluorescensmikroskopi och molekylär genotypning

Published: November 09, 2020
doi:
10.3791/61897
, ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza),Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX),Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

Summary

En metod för bestämning av pollineringskrav i japanska hybrider av plommontyp beskrivs, som kombinerar fält- och laboratoriebestämningar och observationer av pollenrör under fluorescensmikroskopi med identifiering av S-genotyper genom PCR och övervakning av blomning för val av pollinizers.

Abstract

De japanska plommonsorter som vanligen odlas är interspecifika hybrider som härrör från korsningar mellan den ursprungliga Prunus salicina med andra Prunus-arter. De flesta hybrider uppvisar gametophytic självkompatibilitet, som styrs av en enda och mycket polymorf S-locus som innehåller flera alleler. De flesta odlade hybrider är självkompatibla och behöver pollen från en kompatibel donator för att befrukta sina blommor. Att fastställa pollineringskrav i japansk plommon blir allt viktigare på grund av det stora antalet nya sorter med okända pollineringskrav. I detta arbete beskrivs en metod för bestämning av pollineringskrav i japanska plommonhybrider. Självkompatibiliteten bestäms av handbestämningar både på fältet och i laboratoriet, följt av övervakning av förlängningen av pollenröret med fluorescensmikroskopi och övervakning av fruktmognad på fältet. Val av pollinizer sorter bedöms genom att kombinera identifiering av S-genotyper genom PCR analys med övervakning av blomningstid i fältet. Att känna till pollineringskraven för sorter underlättar valet av sorter för utformning av nya fruktträdgårdar och gör det möjligt att tidigt upptäcka produktivitetsproblem relaterade till pollineringsbrist i etablerade fruktträdgårdar.

Introduction

Japansk plommon (Prunus salicina Lindl.) är infödd till Kina1. På 1800-talet introducerades denna gröda från Japan till USA, där den korsades med andra nordamerikanska diploida plommon2. Under 1900-talet spreds några av dessa hybrider till tempererade regioner runt om i världen. Numera hänvisar termen “japansk plommon” till ett brett utbud av interspecifika hybrider som härrör från kors mellan den ursprungliga P. salicina med upp till 15 andra diploida Prunus spp.3,4,5.

Japansk plommon, liksom andra arter av Rosaceae-familjen, uppvisar Gametophytic Self-Incompatibility (GSI), som kontrolleras av en enda och mycket polymorf S-locussom innehåller flera alleler6. S-locusinnehåller två gener som kodar en ribonukleas (S-RNase) uttryckt i pistillen och ett F-boxprotein (SFB) uttryckt i pollenkornet7. I självinkompatibilitetsreaktionen, när S-allelen uttryckt i pollenkornet (haploid) är densamma som en av de två uttryckta i pistillen (diploid), arresteras pollenrörets tillväxt över stilen på grund av nedbrytningen av pollenrörets RNA genom verkan av S-RNase8. Eftersom denna process förhindrar befruktning av den kvinnliga gametofyten i äggstocken, främjar GSI outcrossing mellan sorter.

Även om vissa japanska plommonsorter är självkompatibla, är de flesta sorter som för närvarande odlas självkompatibla och behöver pollen från interkompatibla givare för att befrukta sina blommor3. I stenfruktarter av släktet Prunus som mandel9, aprikos10,11,12 och söt körsbär13kan pollineringskrav för sorter fastställas genom olika tillvägagångssätt. Självkompatibilitet kan bestämmas genom självbestämning av blommor i fält och efterföljande övervakning av fruktuppsättning, eller genom semi-in vivo självbestämningar vid kontrollerade förhållanden i ett laboratorium och observation av pollenrör under mikroskopet14,15,16,17,18 . Inkompatibilitetsförhållanden mellan sorter kan bestämmas genom korsbestämningar i fältet eller laboratoriet med pollen från den potentiella pollinizer-sorten, och genom identifiering av S-alleler av varje sort genom PCR-analys14,15,16,19,20,21,22 . Hos arter som söt körsbär eller mandel kan självkompatibiliteten också bedömas genom identifiering av särskilda S-alleler i samband med självkompatibilitet, som S4‘ i söt körsbär13 eller Sf i mandel23.

Flera plommonuppfödningsprogram från de viktigaste producerande länderna släpper ut ett antal nya sorter2,14, många av dem med okända pollineringskrav. I detta arbete beskrivs en metod för bestämning av pollineringskrav i japanska plommonhybrider. Självkompatibiliteten bestäms av självbestämningar inom både fältet och laboratoriet, följt av observationer av pollenrör under fluorescensmikroskopin. Val av pollinizer sorter kombinerar identifieringen av S-genotyper genom PCR-analys med övervakning av blomningstid i fältet.

Protocol

1. Handbestämning på fältet Pollenextraktion För att få pollen, samla blomknoppar i steg D24, enligt steg 57 på BBCH-skalan25,26.OBS: Fler blomknoppar är nödvändiga i japansk plommon än i andra Prunus-arter eftersom deras anthers producerar mindre pollen. Ta bort anthersna med ett plastnät (2 mm x 2 mm porstorlek) och placera dem på papper i rumstemperatur i 24 timma…

Representative Results

Varje japansk plommonblomsknopp innehåller en blomställning med 1-3 blommor. Liksom i andra stenfruktarter består varje blomma av fyra virvlar: carpel, ståndare, kronblad och foderblad, som smälts och bildar en kopp vid blommans botten. Blomstrukturer är mindre än andra stenfrukter, med en kort och bräcklig pistill omgiven av ståndarna som innehåller en liten mängd pollenkorn. Vid full blomning visas blommorna i varje blomställning separerade på korta stjälkar, som visar de vita kronbladen som bildar en bal…

Discussion

Den metod som beskrivs häri för pollineringskrav för japanska plommonsorter kräver att man fastställer varje sorts självkompatibilitet genom kontrollerade pollineringar på fältet eller i laboratoriet och efterföljande observation av pollenrörstillväxt med fluorescensmikroskopi. Inkompatibilitetsrelationerna upprättas genom karakteriseringen av S-allelerna genom molekylär genotypning. Slutligen utförs valet av pollinizers av övervakningsfenologin för att upptäcka de sorter som sammanfaller vid bl…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna forskning finansierades av Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 och RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón– Europeiska socialfonden, Europeiska unionen (Grupo Consolidado A12-17R) och Junta de Extremadura –Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero stöddes av ett stipendium från Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología från México (CONACYT, 471839).

Materials

Acetic Acid Glacial Panreac 131008.1611
Agar iNtRON Biotechnology 25999
Aniline blue Difco 8504-88
Boric Acid (H3BO4) Panreac 131015.1210
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) Panreac 131231.1211
Coverglass Deltalab D102460 24 mm x 60 mm
Digital Camera Imaging Developmet Systems UI-1490SE
Digital Camera Software Suite Imaging Developmet Systems 4.93.0.
DNA Oligos ThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM each ThermoSischer Scientific R0193
DreamTaq Green DNA polymerase ThermoFisher Scientific EP0713
Ethanol 96° VWR-Chemicals 83804.360
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) Invitrogen 15615-016 Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl
Gel Documentation System Bio-Rad 1708195
Hand Counter Tamaco TM-4
Image Lab Software Bio-Rad Image Analyse System for Gel Documentation System
MetaPhor Agarose Lonza 50180
Microcentrifuge 5415 R Eppendorf Z605212
Microscope with UV epiflurescence Leica DM2500 Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425
Microslides Deltalab D100004 26 mm x 76 mm
Mini Electrophoresis System Fisherbrand 14955170
Minicentrifuge ThermoFisher Scientific 15334204
NanoDrop 1000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND1000
Petri Dishes Deltalab 200201 55 mm x 14 mm
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) Panreac 141513
Primer forward 'Pru C2' ThermoFisher Scientific
Primer forward Pru T2' ThermoFisher Scientific
Primer reverse 'PCER' ThermoFisher Scientific
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution iNtRON Biotechnology 21141
Saccharose Panreac 131621.1211
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) Panreac 131717.1211
Speedtools plant DNA extraction Kit Biotools 21272
TBE Buffer (10X) Panreac A0972,5000PE
Thermal Cycler T100 Bio-Rad 1861096
Thermomixer comfort Eppendorf T1317
Vertical Autoclave Presoclave II JP Selecta 4001725
Vortex Fisherbrand 11746744
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hendrick, U. P. . The Plums of New York. , (1911).
  2. Okie, W. R., Hancock, J. F., Hancock, J. F. Plums. Temperate Fruit Crop Breeding. , 337-357 (2008).
  3. Guerra, M. E., Rodrigo, J. Japanese plum pollination: a review. Scientia Horticulturae. 197, 674-686 (2015).
  4. Okie, W. R. Introgression of Prunus species in plum. New York Fruit Quarterly. 14 (1), 29-37 (2006).
  5. Okie, W. R., Weinberger, J. H., Janick, J., Moore, J. . Fruit Breeding, vol. 1. Tree and tropical fruits. , 559-608 (1996).
  6. Mccubbin, A. G., Kao, T. Molecular recognition and response in pollen and pistil interactions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 333-364 (2000).
  7. Hegedűs, A., Halász, J. Recent findings of the tree fruit self-incompatibility studies. International Journal of Horticultural Science. 13 (2), 7-15 (2007).
  8. de Nettancourt, D. . Incompatibility and Incongruity in Wild and Cultivated Plants. , (2001).
  9. Tao, R., et al. Identification of stylar RNases associated with gametophytic self-incompatibility in almond (Prunus dulcis). Plant and Cell Physiology. 38 (3), 304-311 (1997).
  10. Halász, J., Pedryc, A., Ercisli, S., Yilmaz, K., Hegedűs, A. S-genotyping supports the genetic relationships between Turkish and Hungarian apricot germplasm. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (5), 410-417 (2010).
  11. Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Self-incompatibility and S-allele identification in new apricot cultivars. Acta Horticulturae. (1231), 171-176 (2019).
  12. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
  13. Cachi, A. M., Wunsch, A. Characterization of self-compatibility in sweet cherry varieties by crossing experiments and molecular genetic analysis. Tree Genetics & Genomes. 10, 1205-1212 (2014).
  14. Guerra, M. E., Guerrero, B. I., Casadomet, C., Rodrigo, J. Self-compatibility, S-RNase allele identification, and selection of pollinizers in new Japanese plum-type cultivars. Scientia Horticulturae. 261, 109022 (2020).
  15. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 1-12 (2018).
  16. Herrera, S., Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Lora, J. Identification of self-incompatibility alleles by specific PCR analysis and S-RNase sequencing in apricot. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3612 (2018).
  17. Sociasi Company, R., Kodad, O., Fernández i Martí, J. M., Alonso, J. M. Mutations conferring self-compatibility in Prunus species: from deletions and insertions to epigenetic alterations. Scientia Horticulturae. 192, 125-131 (2015).
  18. Rodrigo, J., Herrero, M. Evaluation of pollination as the cause of erratic fruit set in apricot ‘Moniqui. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 71 (5), 801-805 (1996).
  19. Beppu, K., et al. Se-haplotype confers self-compatibility in Japanese plum (Prunus salicina Lindl). Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 80 (6), 760-764 (2005).
  20. Guerra, M. E., Rodrigo, J., López-Corrales, M., Wünsch, A. S-RNase genotyping and incompatibility group assignment by PCR and pollination experiments in Japanese plum. Plant Breeding. 128 (3), 304-311 (2009).
  21. Guerra, M. E., Wunsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Flower emasculation as the cause for lack of fruit set in Japanese plum crosses. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (6), 556-562 (2010).
  22. Guerra, M. E., Wünsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Lack of fruit set caused by ovule degeneration in Japanese plum. Journal of the American Society for Horticultural Science. 136 (6), 375-381 (2011).
  23. Fernández i Martí, A., Gradziel, T. M., Socias i Company, R. Methylation of the Sf locus in almond is associated with S-RNase loss of function. Plant Molecular Biology. 86, 681-689 (2014).
  24. Baggiolini, M. Les stades repérés des arbres fruitiers à noyau. Revue romande d’Agriculture et d’Arboriculture. 8, 3-4 (1952).
  25. Meier, U. Growth stages of mono-and dicotyledonous plants: BBCH Monograph. Federal Biological Research Centre for Agriculture and Forestry. , (2001).
  26. Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Flower development in sweet cherry framed in the BBCH scale. Scientia Horticulturae. 192, 141-147 (2015).
  27. Fadon, E., Rodrigo, J. Combining histochemical staining and image analysis to quantify starch in the ovary primordia of sweet cherry during winter dormancy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
  28. Hormaza, J. I., Pinney, K., Polito, V. S. Correlation in the tolerance to ozone between sporophytes and male gametophytes of several fruit and nut tree species (Rosaceae). Sexual Plant Reproduction. 9, 44-48 (1996).
  29. Burgos, L., et al. The self-compatibility trait of the main apricot cultivars and new selections from breeding programmes. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 72 (1), 147-154 (1997).
  30. Dicenta, F., Ortega, E., Cánovas, J. A., Egea, J. Self-pollination vs. cross-pollination in almond: pollen tube growth, fruit set and fruit characteristics. Plant Breeding. 121, 163-167 (2002).
  31. Alonso, J. M., Socias i Company, R. Differential pollen tube growth in inbred self-compatible almond genotypes. Euphytica. 144, 207-213 (2005).
  32. Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. The effect of temperature on pollen germination, pollen tube growth, and stigmatic receptivity in peach. Plant Biology. 7, 476-483 (2005).
  33. Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. Warm temperatures at bloom reduce fruit set in sweet cherry. Journal of Applied Botany. 81, 158-164 (2007).
  34. Milatović, D., Nikolić, D. Analysis of self-(in)compatibility in apricot cultivars using fluorescence microscopy. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 82, 170-174 (2007).
  35. Jia, H. J., He, F. J., Xiong, C. Z., Zhu, F. R., Okamoto, G. Influences of cross pollination on pollen tube growth and fruit set in Zuili plums (Prunus salicina). Journal of Integrative Plant Biology. 50, 203-209 (2008).
  36. Herrero, M., Salvador, J. La polinización del ciruelo Red Beaut. Información Técnica Econónomica Agraria. 41, 3-7 (1980).
  37. Ramming, D. W. Plum. Register of new fruit and nut varieties: Brooks and Olmo, List 37. HortScience. 30 (6), 1142-1144 (1995).
  38. Hartmann, W., Neümuller, M. Plum breeding. Breeding plantation tree crops: Temperate species. , 161-231 (2009).
  39. Guerra, M. E., López-Corrales, M., Wünsch, A. Improved S-genotyping and new incompatibility groups in Japanese plum. Euphytica. 186 (2), 445-452 (2012).
  40. Tao, R., et al. Molecular typing of S-alleles through identification, characterization and cDNA cloning for S-RNases in sweet cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science. 124 (3), 224-233 (1999).
  41. Yamane, H., Tao, R., Sugiura, A., Hauck, N. R., Lezzoni, A. F. Identification and characterization of S-RNases in tetraploid sour cherry (Prunus cerasus). Journal of the American Society for Horticultural Science. 126, 661-667 (2001).
  42. López, M., Jose, F., Vargas, F. J., Battle, I. Self-(in)compatibility almond genotypes: a review. Euphytica. 150, 1-16 (2006).
  43. Bošković, R., Tobutt, K. R. Correlation of stylar ribonuclease zymograms with incompatibility alleles in sweet cherry. Euphytica. 90, 245-250 (1996).
  44. Beppu, K., Syogase, K., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Inheritance of self-compatibility conferred by the Se-haplotype of Japanese plum and development of Se-RNase gene-specific PCR primers. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 85, 215-218 (2010).
  45. Beppu, K., Kumai, M., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Molecular and genetic analyses of the S-haplotype of the self-compatible Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) “Methley”. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 87 (5), 493-498 (2012).
  46. Beppu, K., Konishi, K., Kataoka, I. S-haplotypes and self-compatibility of the Japanese plum cultivar ‘Karari’. Acta Horticulturae. 929, 261-266 (2012).
  47. Sapir, G., Stern, R. A., Shafir, S., Goldway, M. S-RNase based S-genotyping of Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) and its implication on the assortment of cultivar-couples in the orchard. Scientia Horticulturae. 118, 8-13 (2008).
  48. Karp, D. Luther Burbank’s plums. HortScience. 50 (2), 189-194 (2015).

Tags

Pollination RequirementsJapanese PlumPhenological MonitoringHand PollinationsFluorescence MicroscopyMolecular GenotypingSelf-incompatible CultivarsPollen ExtractionBBCH ScaleFruit SetSelf-pollinationCross-pollinationPollen GerminationFixative SolutionMicroscopy
check_url/fr/61897?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping. J. Vis. Exp. (165), e61897, doi:10.3791/61897 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image