JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie du développement

Fenolojik İzleme, El Tozlaşmaları, Floresan Mikroskopisi ve Moleküler Genotipleme ile Japon Eriğinde Tozlaşma Gereksinimlerinin Oluşturulması

Published: November 09, 2020
doi:
10.3791/61897
, ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza),Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX),Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

Summary

Japon erik tipi melezlerde tozlaşma gereksinimlerinin belirlenmesi için bir metodoloji, floresan mikroskopisi altındaki polen tüplerinin alan ve laboratuvar tozlaşmalarını ve gözlemlerini, S-genotiplerinin PCR tarafından tanımlanması ve tozlayıcıların seçimi için çiçeklenmenin izlenmesi ile birleştiren bir metodoloji açıklanmaktadır.

Abstract

Yaygın olarak yetiştirilen Japon erik kültivatları, orijinal Prunus salicina ile diğer Prunus türleri arasındaki haçlardan elde edilen spesifik melezlerdir. Çoğu melez, birden fazla alel içeren tek ve son derece polimorfik S-locus tarafından kontrol edilen gametofitik kendi kendine uyumsuzluk sergiler. Ekili melezlerin çoğu kendi kendine uyumsuzdur ve çiçeklerini döllemek için uyumlu bir donörden polene ihtiyaç duyarlar. Japon eriği tozlaşma gereksinimlerinin belirlenmesi, bilinmeyen tozlaşma gereksinimlerine sahip yeni kültivarların yüksek sayısı nedeniyle giderek daha önemli hale gelmektedir. Bu çalışmada, Japon erik tipi melezlerde tozlaşma gereksinimlerinin belirlenmesi için bir metodoloji açıklanmıştır. Kendi kendine(in) uyumluluk, hem sahada hem de laboratuvarda el tozlaşmaları ile belirlenir, ardından floresan mikroskopi ile polen tüpü uzaması ve ayrıca alandaki meyve olgunlaşması izlenir. Pollinizer kültivarlarının seçimi, PCRanalizi ile S -genotiplerinin tanımlanması ile alandaki çiçekli zamanın izlenmesi ile birleştirilerek değerlendirilir. Kültivarların tozlaşma gereksinimlerini bilmek, yeni meyve bahçelerinin tasarımı için kültivarların seçimini kolaylaştırır ve kurulan meyve bahçelerinde tozlaşma eksikliği ile ilgili verimlilik sorunlarının erken tespitini sağlar.

Introduction

Japon eriği (Prunus salicina Lindl.)Çin’eözgüdür 1 . 19. yüzyılda, bu ürün Japonya’dan Amerika Birleşik Devletleri’ne tanıtıldı ve burada diğer Kuzey Amerika diploid erikleri2ile kesişen . 20. yüzyılda, bu melezlerin bazıları dünyadakiılıman bölgelere yayıldı. Günümüzde, “Japon eriği” terimi, orijinal P. salicina arasındaki haçlardan elde edilen ve 15 adede kadar diğer diploid Prunus spp. 3 ,4,5ile türetilen çok çeşitli spesifik melezleri ifade eder.

Japon eriği, Rosaceae ailesinin diğer türleri gibi, birden fazla alel içeren tek ve son derece polimorfik S-locus tarafından kontrol edilen Gametophytic Self-Incompatibility (GSI) sergiler6. S-locus, pistilde ifade edilen bir ribononikleaz(S-RNase)ve polen tanesinde ifade edilen bir F kutusu proteinini (SFB) kodlayan iki gen içerir7. Kendi kendine uyumsuzluk reaksiyonunda, polen tanesinde (haploid) ifade edilen S-alele pistil (diploid) ile ifade edilen ikiden biriyle aynı olduğunda, polen tüpünün stil boyunca büyümesi, polen tüpü RNA’nın S-RNase8’inetkisiyle bozulması nedeniyle tutuklanır. Bu işlem ovuledeki kadın gametofitin döllenmesini önlediğinden, GSI kültivarlar arasındaki çıkıntları teşvik eder.

Bazı Japon erik kültivarları kendi kendine uyumlu olsa da, şu anda yetiştirilen çoğu kültivar kendi kendine uyumsuzdur ve çiçeklerini döllemek için inter-uyumlu donörlerden polen gerekir3. Badem9 , kayısı 10 ,11,12ve tatlı kiraz13 gibi Prunu cinsi taş meyve türlerinde, kültivarların tozlaşma gereksinimleri farklı yaklaşımlarla oluşturulabilir. Kendi kendine (in) uyumluluk, alandaki çiçeklerin kendi kendine tozlaşması ve daha sonra meyve setinin izlenmesi veya bir laboratuvarda kontrollü koşullarda yarı in vivo kendi kendine tozlaşma ve polen tüplerinin mikroskop altında gözlemlenmesi ile belirlenebilir14,15,16,17,18 . Kültivarlar arasındaki uyumsuzluk ilişkileri, potansiyel pollinizer kültivarının polenleri kullanılarak alandaki veya laboratuvarda çapraz tozlaşmalar ve her bir kültivarın S-allellerinin PCR analizi ile tanımlanması ile belirlenebilir14, 15,16,19,20,21,22 . Tatlı kiraz veya badem gibi türlerde, kendi kendine (in) uyumluluk, tatlı kiraz 13’te S 4‘ veya badem23’te Sf olarak, kendi kendine uyumlulukla ilişkili belirli Salellerinin tanımlanmasıyla da değerlendirilebilir.

Ana üretim ülkelerinden birkaç erik yetiştirme programı, birçoğu bilinmeyen tozlaşma gereksinimlerine sahip bir dizi yeni kültivar2,14. Bu çalışmada, Japon erik tipi melezlerde tozlaşma gereksinimlerinin belirlenmesi için bir metodoloji açıklanmıştır. Kendi kendine(in) uyumluluk, hem alandaki hem de laboratuvardaki kendi kendine tozlaşmalar ve ardından floresan mikroskopisi altındaki polen tüplerinin gözlemleri ile belirlenir. Pollinizer kültivarlarının seçimi, PCRanalizi ile S -genotiplerinin tanımlanmasını alandaki çiçekli zamanın izlenmesi ile birleştirir.

Protocol

1. Alanda el tozlaşması Polen ekstraksiyonu Polen elde etmek için, D24aşamasında çiçek tomurcukları toplayın BBCHölçeğinde57.NOT: Japon erikinde diğer Prunus türlerine göre daha fazla çiçek tomurcukları gereklidir, çünkü anterleri daha az polen üretir. Anterleri plastik bir ağ (2 mm x 2 mm gözenek boyutu) kullanarak çıkarın ve anter dehiscence olana ka…

Representative Results

Her Japon erik çiçeği tomurcukları 1-3 çiçekli bir çiçek salkım içerir. Diğer taş meyve türlerinde olduğu gibi, her çiçek dört whorls oluşur: çiçeğin tabanında bir fincan oluşturan kaynaşmış karpel, stamens, yaprakları ve sepals. Çiçek yapıları diğer taş meyvelerden daha küçüktür, az miktarda polen tanesi içeren stamenlerle çevrili kısa ve kırılgan bir pistil vardır. Tam çiçeklenmede, her çiçeklenmenin çiçekleri kısa saplarda ayrılır ve beyaz yaprakların anesteziden ö…

Discussion

Japon erik kültivatörlerinin tozlaşma gereksinimleri için burada açıklanan metodoloji, her bir kültivarın sahadaki veya laboratuvarda kontrollü tozlaşmalarla kendi kendine (in) uyumluluğunun belirlenmesini ve daha sonra polen tüpü büyümesinin floresan mikroskopi ile gözlemlenmesini gerektirir. Uyumsuzluk ilişkileri, S-alellerinin moleküler genotipleme ile karakterize edilmesiyle kurulur. Son olarak, pollinizerlerin seçimi, her yıl çiçekle çakışan kültivarları tespit etmek için izleme …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 ve RTA2017-00003-00) tarafından finanse edildi; Gobierno de Aragón—Avrupa Sosyal Fonu, Avrupa Birliği (Grupo Consolidado A12-17R) ve Junta de Extremadura —Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero, México’lu Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología’nın (CONACYT, 471839) bir bursu ile desteklendi.

Materials

Acetic Acid Glacial Panreac 131008.1611
Agar iNtRON Biotechnology 25999
Aniline blue Difco 8504-88
Boric Acid (H3BO4) Panreac 131015.1210
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O) Panreac 131231.1211
Coverglass Deltalab D102460 24 mm x 60 mm
Digital Camera Imaging Developmet Systems UI-1490SE
Digital Camera Software Suite Imaging Developmet Systems 4.93.0.
DNA Oligos ThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM each ThermoSischer Scientific R0193
DreamTaq Green DNA polymerase ThermoFisher Scientific EP0713
Ethanol 96° VWR-Chemicals 83804.360
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb) Invitrogen 15615-016 Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl
Gel Documentation System Bio-Rad 1708195
Hand Counter Tamaco TM-4
Image Lab Software Bio-Rad Image Analyse System for Gel Documentation System
MetaPhor Agarose Lonza 50180
Microcentrifuge 5415 R Eppendorf Z605212
Microscope with UV epiflurescence Leica DM2500 Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425
Microslides Deltalab D100004 26 mm x 76 mm
Mini Electrophoresis System Fisherbrand 14955170
Minicentrifuge ThermoFisher Scientific 15334204
NanoDrop 1000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND1000
Petri Dishes Deltalab 200201 55 mm x 14 mm
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O) Panreac 141513
Primer forward 'Pru C2' ThermoFisher Scientific
Primer forward Pru T2' ThermoFisher Scientific
Primer reverse 'PCER' ThermoFisher Scientific
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution iNtRON Biotechnology 21141
Saccharose Panreac 131621.1211
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3) Panreac 131717.1211
Speedtools plant DNA extraction Kit Biotools 21272
TBE Buffer (10X) Panreac A0972,5000PE
Thermal Cycler T100 Bio-Rad 1861096
Thermomixer comfort Eppendorf T1317
Vertical Autoclave Presoclave II JP Selecta 4001725
Vortex Fisherbrand 11746744
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hendrick, U. P. . The Plums of New York. , (1911).
  2. Okie, W. R., Hancock, J. F., Hancock, J. F. Plums. Temperate Fruit Crop Breeding. , 337-357 (2008).
  3. Guerra, M. E., Rodrigo, J. Japanese plum pollination: a review. Scientia Horticulturae. 197, 674-686 (2015).
  4. Okie, W. R. Introgression of Prunus species in plum. New York Fruit Quarterly. 14 (1), 29-37 (2006).
  5. Okie, W. R., Weinberger, J. H., Janick, J., Moore, J. . Fruit Breeding, vol. 1. Tree and tropical fruits. , 559-608 (1996).
  6. Mccubbin, A. G., Kao, T. Molecular recognition and response in pollen and pistil interactions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 333-364 (2000).
  7. Hegedűs, A., Halász, J. Recent findings of the tree fruit self-incompatibility studies. International Journal of Horticultural Science. 13 (2), 7-15 (2007).
  8. de Nettancourt, D. . Incompatibility and Incongruity in Wild and Cultivated Plants. , (2001).
  9. Tao, R., et al. Identification of stylar RNases associated with gametophytic self-incompatibility in almond (Prunus dulcis). Plant and Cell Physiology. 38 (3), 304-311 (1997).
  10. Halász, J., Pedryc, A., Ercisli, S., Yilmaz, K., Hegedűs, A. S-genotyping supports the genetic relationships between Turkish and Hungarian apricot germplasm. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (5), 410-417 (2010).
  11. Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Self-incompatibility and S-allele identification in new apricot cultivars. Acta Horticulturae. (1231), 171-176 (2019).
  12. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), (2020).
  13. Cachi, A. M., Wunsch, A. Characterization of self-compatibility in sweet cherry varieties by crossing experiments and molecular genetic analysis. Tree Genetics & Genomes. 10, 1205-1212 (2014).
  14. Guerra, M. E., Guerrero, B. I., Casadomet, C., Rodrigo, J. Self-compatibility, S-RNase allele identification, and selection of pollinizers in new Japanese plum-type cultivars. Scientia Horticulturae. 261, 109022 (2020).
  15. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 1-12 (2018).
  16. Herrera, S., Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Lora, J. Identification of self-incompatibility alleles by specific PCR analysis and S-RNase sequencing in apricot. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3612 (2018).
  17. Sociasi Company, R., Kodad, O., Fernández i Martí, J. M., Alonso, J. M. Mutations conferring self-compatibility in Prunus species: from deletions and insertions to epigenetic alterations. Scientia Horticulturae. 192, 125-131 (2015).
  18. Rodrigo, J., Herrero, M. Evaluation of pollination as the cause of erratic fruit set in apricot ‘Moniqui. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 71 (5), 801-805 (1996).
  19. Beppu, K., et al. Se-haplotype confers self-compatibility in Japanese plum (Prunus salicina Lindl). Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 80 (6), 760-764 (2005).
  20. Guerra, M. E., Rodrigo, J., López-Corrales, M., Wünsch, A. S-RNase genotyping and incompatibility group assignment by PCR and pollination experiments in Japanese plum. Plant Breeding. 128 (3), 304-311 (2009).
  21. Guerra, M. E., Wunsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Flower emasculation as the cause for lack of fruit set in Japanese plum crosses. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (6), 556-562 (2010).
  22. Guerra, M. E., Wünsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Lack of fruit set caused by ovule degeneration in Japanese plum. Journal of the American Society for Horticultural Science. 136 (6), 375-381 (2011).
  23. Fernández i Martí, A., Gradziel, T. M., Socias i Company, R. Methylation of the Sf locus in almond is associated with S-RNase loss of function. Plant Molecular Biology. 86, 681-689 (2014).
  24. Baggiolini, M. Les stades repérés des arbres fruitiers à noyau. Revue romande d’Agriculture et d’Arboriculture. 8, 3-4 (1952).
  25. Meier, U. Growth stages of mono-and dicotyledonous plants: BBCH Monograph. Federal Biological Research Centre for Agriculture and Forestry. , (2001).
  26. Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Flower development in sweet cherry framed in the BBCH scale. Scientia Horticulturae. 192, 141-147 (2015).
  27. Fadon, E., Rodrigo, J. Combining histochemical staining and image analysis to quantify starch in the ovary primordia of sweet cherry during winter dormancy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
  28. Hormaza, J. I., Pinney, K., Polito, V. S. Correlation in the tolerance to ozone between sporophytes and male gametophytes of several fruit and nut tree species (Rosaceae). Sexual Plant Reproduction. 9, 44-48 (1996).
  29. Burgos, L., et al. The self-compatibility trait of the main apricot cultivars and new selections from breeding programmes. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 72 (1), 147-154 (1997).
  30. Dicenta, F., Ortega, E., Cánovas, J. A., Egea, J. Self-pollination vs. cross-pollination in almond: pollen tube growth, fruit set and fruit characteristics. Plant Breeding. 121, 163-167 (2002).
  31. Alonso, J. M., Socias i Company, R. Differential pollen tube growth in inbred self-compatible almond genotypes. Euphytica. 144, 207-213 (2005).
  32. Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. The effect of temperature on pollen germination, pollen tube growth, and stigmatic receptivity in peach. Plant Biology. 7, 476-483 (2005).
  33. Hedhly, A., Hormaza, J. I., Herrero, M. Warm temperatures at bloom reduce fruit set in sweet cherry. Journal of Applied Botany. 81, 158-164 (2007).
  34. Milatović, D., Nikolić, D. Analysis of self-(in)compatibility in apricot cultivars using fluorescence microscopy. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 82, 170-174 (2007).
  35. Jia, H. J., He, F. J., Xiong, C. Z., Zhu, F. R., Okamoto, G. Influences of cross pollination on pollen tube growth and fruit set in Zuili plums (Prunus salicina). Journal of Integrative Plant Biology. 50, 203-209 (2008).
  36. Herrero, M., Salvador, J. La polinización del ciruelo Red Beaut. Información Técnica Econónomica Agraria. 41, 3-7 (1980).
  37. Ramming, D. W. Plum. Register of new fruit and nut varieties: Brooks and Olmo, List 37. HortScience. 30 (6), 1142-1144 (1995).
  38. Hartmann, W., Neümuller, M. Plum breeding. Breeding plantation tree crops: Temperate species. , 161-231 (2009).
  39. Guerra, M. E., López-Corrales, M., Wünsch, A. Improved S-genotyping and new incompatibility groups in Japanese plum. Euphytica. 186 (2), 445-452 (2012).
  40. Tao, R., et al. Molecular typing of S-alleles through identification, characterization and cDNA cloning for S-RNases in sweet cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science. 124 (3), 224-233 (1999).
  41. Yamane, H., Tao, R., Sugiura, A., Hauck, N. R., Lezzoni, A. F. Identification and characterization of S-RNases in tetraploid sour cherry (Prunus cerasus). Journal of the American Society for Horticultural Science. 126, 661-667 (2001).
  42. López, M., Jose, F., Vargas, F. J., Battle, I. Self-(in)compatibility almond genotypes: a review. Euphytica. 150, 1-16 (2006).
  43. Bošković, R., Tobutt, K. R. Correlation of stylar ribonuclease zymograms with incompatibility alleles in sweet cherry. Euphytica. 90, 245-250 (1996).
  44. Beppu, K., Syogase, K., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Inheritance of self-compatibility conferred by the Se-haplotype of Japanese plum and development of Se-RNase gene-specific PCR primers. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 85, 215-218 (2010).
  45. Beppu, K., Kumai, M., Yamane, H., Tao, R., Kataoka, I. Molecular and genetic analyses of the S-haplotype of the self-compatible Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) “Methley”. Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 87 (5), 493-498 (2012).
  46. Beppu, K., Konishi, K., Kataoka, I. S-haplotypes and self-compatibility of the Japanese plum cultivar ‘Karari’. Acta Horticulturae. 929, 261-266 (2012).
  47. Sapir, G., Stern, R. A., Shafir, S., Goldway, M. S-RNase based S-genotyping of Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) and its implication on the assortment of cultivar-couples in the orchard. Scientia Horticulturae. 118, 8-13 (2008).
  48. Karp, D. Luther Burbank’s plums. HortScience. 50 (2), 189-194 (2015).

Tags

Pollination RequirementsJapanese PlumPhenological MonitoringHand PollinationsFluorescence MicroscopyMolecular GenotypingSelf-incompatible CultivarsPollen ExtractionBBCH ScaleFruit SetSelf-pollinationCross-pollinationPollen GerminationFixative SolutionMicroscopy
check_url/fr/61897?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping. J. Vis. Exp. (165), e61897, doi:10.3791/61897 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image