सैंड फ्लाई (Phlebotomus papatasi) CRISPR के लिए भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन/
Summary
इस प्रोटोकॉल में रेत मक्खियों में CRISPR/Cas9 लक्षित म्यूटागेनेसिस के कदमों का विवरण दिया गया है: भ्रूण संग्रह, इंजेक्शन, कीट पालन, और पहचान के साथ-साथ ब्याज के उत्परिवर्तनों का चयन ।
Abstract
रेत मक्खियों लीशमैनिया प्रजातियों के लिए प्राकृतिक वैक्टर हैं, प्रोटोज़ोन परजीवी कटनीस घावों से लेकर आंत विकृति तक के लक्षणों के व्यापक स्पेक्ट्रम का उत्पादन करते हैं। वेक्टर/परजीवी बातचीत की प्रकृति को समझना उनके मेजबानों को लीशमैनिया संचरण की बेहतर समझ के लिए प्राथमिक महत्व का है । रेत फ्लाई वेक्टर क्षमता (यानी रोगजनकों को ले जाने और संचारित करने की उनकी क्षमता) को नियंत्रित करने वाले मापदंडों में से, इन कीड़ों के लिए आंतरिक पैरामीटर एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हुए दिखाए गए थे। कीट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, उदाहरण के लिए, लीशमैनियाके लिए रेत फ्लाई वेक्टर क्षमता को प्रभावित करती है। इन गैर-मॉडल जीवों में उपयोग के लिए अनुकूलित जीन अभिव्यक्ति संशोधन के तरीकों की कमी से ऐसे मापदंडों का अध्ययन सीमित किया गया है । छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरएनए) द्वारा जीन डाउनरेगुलेशन संभव है, लेकिन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण होने के अलावा, मुंह बंद करने से केवल कार्य का आंशिक नुकसान होता है, जिसे पीढ़ी दर पीढ़ी प्रेषित नहीं किया जा सकता है। CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी द्वारा लक्षित म्यूटेगेनिसिस को हाल ही में फ्लेबोटोमस पैपटासी रेत फ्लाई के लिए अनुकूलित किया गया था । यह तकनीक विशेष रूप से चुने गए लोकस में संक्रामक उत्परिवर्तनों की पीढ़ी की ओर ले जाती है, जिससे ब्याज के जीन का अध्ययन करने की अनुमति होती है। CRISPR/Cas9 प्रणाली लक्षित डबल-स्ट्रैंड डीएनए ब्रेक के शामिल होने पर निर्भर करती है, बाद में या तो गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने (एनएचईजे) या होमोलॉजी ड्रिवेन रिपेयर (एचडीआर) द्वारा मरम्मत की जाती है । NHEJ को तोड़ने के एक साधारण बंद के होते है और अक्सर छोटे प्रविष्टि की ओर जाता है/ इसके विपरीत, एचडीआर मरम्मत के लिए एक टेम्पलेट के रूप में लक्ष्य डीएनए के साथ एक दाता डीएनए अणु साझा होमोलॉजी की उपस्थिति का उपयोग करता है। यहां, हम NHEJ का उपयोग कर CRISPR/Cas9 द्वारा लक्षित म्यूटेनेसिस के लिए एक रेत फ्लाई भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन विधि प्रस्तुत करते हैं, जो आज तक रेत फ्लाई वैक्टर के अनुकूल एकमात्र जीनोम संशोधन तकनीक है ।
Introduction
वेक्टर जनित रोग निरंतर विकास में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरा हैं । विश्व स्वास्थ्य संगठन के अनुसार, बहुत अलग फिलोजेनिक परिवारों (जैसे, मच्छर, टिक, फ्लीस) में फैले सैकड़ों वेक्टर प्रजातियां बड़ी संख्या में माइक्रोबियल रोगजनकों के संचरण के लिए जिम्मेदार हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक साल में 700,000 से अधिक मानव मौतें होती हैं। वेक्टर कीड़ों में, फ्लेबोटोमाइन रेत मक्खियों (डिप्टेरा, साइकोडीडी) एक विशाल समूह का गठन करते हैं, जिसमें 80 सिद्ध वेक्टर प्रजातियां विभिन्न भौगोलिक क्षेत्रों में पाई जाने वाली विशिष्ट फेनोटाइपिक लक्षण और वेक्टरल क्षमताओं का प्रदर्शन करती हैं। वे लीशमैनियाजीनस के प्रोटोज़ोन परजीवी के लिए वैक्टर हैं, जिससे लीशमैनियास के लगभग 1.3 मिलियन नए मामले होते हैं और एक साल में 20,000 और 30,000 मौतों के बीच। लीशमैनियास नैदानिक परिणाम विविध होते हैं, जिसमें आत्म-सीमित क्यूटेनियस घावों से लेकर आंत के प्रसार तक के लक्षण होते हैं जो उपचार के अभाव में घातक होते हैं।
रेत मक्खियों सख्ती से स्थलीय कीड़े हैं। उनका जीवन चक्र, अन्य डिप्टेरा की तुलना में अपेक्षाकृत लंबा, तापमान, आर्द्रता और पोषण जैसे विभिन्न मापदंडों के आधार पर तीन महीने तक रहता है। इसमें एक भ्रूणीय चरण (6 से 11 दिन), चार लार्वा चरण (कुल 23 से 25 दिनों तक चलने वाले) और एक प्यूपल चरण (9 से 10 दिन) होते हैं जिसके बाद कायापलट और फिर वयस्कता होती है। रेत मक्खियों को पालने के लिए आर्द्र और गर्म वातावरण की आवश्यकता होती है। नर और मादा दोनों शर्करा पर भोजन करते हैं, जो फूल अमृत से जंगली में प्राप्त होते हैं। केवल मादाएं रक्त-फीडर होती हैं, क्योंकि उन्हें अंडा उत्पादन के लिए रक्त भोजन से प्राप्त प्रोटीन की आवश्यकता होती है1.
अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण ध्यान वेक्टर/परजीवी बातचीत की प्रकृति की पहचान करना है जो संक्रामक संक्रमणों के विकास का कारण बनता है । अन्य वेक्टर कीड़ों के साथ, रेत मक्खियों के लिए आंतरिक मापदंडों को उनकी वेक्टर क्षमता को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, जिसे उनके मेजबानों को रोगजनकों को ले जाने और संचारित करने की उनकी क्षमता के रूप में परिभाषित किया गया है। उदाहरण के लिए, फलेबोटोमस पैपटासी रेत फ्लाई मिडगट कोशिकाओं द्वारा गैलेक्टिन की अभिव्यक्ति, परजीवी सतह घटकों को पहचानने वाले रिसेप्टर्स के रूप में कार्य करती है, सीधे लीशमैनिया प्रमुख2, 3के लिए उनकी वेक्टर क्षमता को प्रभावित कर सकती है। कीट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मार्ग, प्रतिरक्षा कमी (आईएमडी), लीशमैनिया प्रमुख4के लिए फ्लेबोटोमस पापतासी रेत फ्लाई वेक्टर क्षमता के लिए भी महत्वपूर्ण है। संक्रामक रोगजनकों के संचरण को नियंत्रित करने में वेक्टर कीट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मार्गों के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका इसीतरह एडीज एजिप्टी मच्छरों 5,6,7,tsetse फ्लाई ग्लॉसीना मोर्सिटन्स8में और एनोफेलीज गैम्बिया मच्छरों में 9,10में सूचित किया गया है ।
इन कीटों में उपयोग के लिए अनुकूलित जीन अभिव्यक्ति संशोधन विधियों की कमी से रेतफ्लाई/लीश्मेनिया इंटरैक्शन के अध्ययन सीमित हो गए हैं । हाल ही में जब तक छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) द्वारा केवल जीन डाउनरेगुलेशन11,12,13,14 किया गया था । वयस्क महिलाओं के माइक्रोइंजेक्शन से जुड़ी मृत्यु दर से सीमित तकनीक केवल कार्य के आंशिक नुकसान की ओर ले जाती है, जिसे पीढ़ी दर पीढ़ी प्रेषित नहीं किया जा सकता है।
CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी ने रेत मक्खियों जैसे गैर-मॉडल जीवों में कार्यात्मक जीनोमिक अनुसंधान में क्रांति ला दी है । बैक्टीरियोफेज15, 16के खिलाफ रक्षा के लिए प्रोकैरियोट्स में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली से संशोधित, CRISPR Cas9 प्रणाली को कीड़ों सहित बेहतर यूकेरियोटिक जीवों के लिए जीनोम संपादन उपकरण के रूप में तेजी से अनुकूलित किया गया है। CRISPR/Cas9 लक्षित जीनोम संपादन का सिद्धांत एक विशिष्ट जीनोमिक लोकस के लिए एक गाइड आरएनए (sgRNA) की पूरकता पर आधारित है । Cas9 नाभिक sgRNA के लिए बांधता है और जीनोमिक डीएनए में एक डबल स्ट्रैंड डीएनए (dsDNA) तोड़ बनाता है, जहां sgRNA अपने पूरक अनुक्रम के साथ सहयोगियों । Cas9-sgRNA परिसर को चुने हुए लोकस के लिए sgRNA में 17 से 20 पूरक ठिकानों द्वारा लक्ष्य अनुक्रम के लिए निर्देशित किया जाता है, DsDNA तोड़ तो दो स्वतंत्र रास्ते द्वारा मरंमत की जा सकती है: nonhomologous अंत में शामिल होने (NHEJ) या होमोलॉजी निर्देशित मरम्मत (HDR)17। NHEJ मरम्मत को तोड़ने के एक साधारण बंद शामिल है, लेकिन अक्सर छोटे प्रविष्टि की ओर जाता है/ एचडीआर के माध्यम से डीएनए मरम्मत मरम्मत के लिए एक टेम्पलेट के रूप में लक्ष्य डीएनए के साथ एक दाता डीएनए अणु साझा होमोलॉजी का उपयोग करता है। कीड़े दोनों मशीनों के अधिकारी हैं।
CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी NHEJ मरम्मत मार्ग के माध्यम से, एक चुने हुए लोकस में उत्परिवर्तन उत्पन्न कर सकते हैं; या अधिक जटिल जीनोम संपादन रणनीतियों के लिए, जैसे नॉक-इन या अभिव्यक्ति संवाददाताओं, एक उपयुक्त दाता टेम्पलेट के साथ एचडीआर मार्ग के माध्यम से। रेत मक्खियों में, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया कारक स्वाद के शून्य उत्परिवर्ती एलील्स Phlebotomus papatasi4में NHEJ मध्यस्थता CRISPR के माध्यम से उत्पन्न किए गए थे । रेत मक्खी भ्रूण भी एक CRISPR के साथ एक और अध्ययन में इंजेक्शन थे/Cas9 मिश्रण जीन एन्कोडिंग पीले लक्ष्यीकरण । फिर भी, उत्परिवर्तन ले जाने वाले किसी वयस्क का उत्पादन नहीं किया गया18। हम यहां NHEJ-मध्यस्थता CRISPR/Cas9 द्वारा रेत मक्खी लक्षित mutagenesis की एक विस्तृत विधि का वर्णन, भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन, प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम पर एक विशेष ध्यान के साथ ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहां फूलबोटोमस पैपटासी रेत मक्खियों में CRISPR/Cas9 द्वारा लक्षित म्यूटेनेसिस के लिए हाल ही में विकसित भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन विधि पेश करते हैं । कीट आनुवंशिक संशोधन के लिए भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन 1980 क?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए वैनेसा मेल्डेनर-हैरेल का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
References
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