Sandfliege (Phlebotomus papatasi) Embryo Mikroinjektion für CRISPR/Cas9 Mutagenese
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte der gezielten Mutagenese von CRISPR/Cas9 bei Sandfliegen: Embryoentnahme, Injektion, Insektenzucht und -identifikation sowie Auswahl von Mutationen von Interesse.
Abstract
Sandfliegen sind die natürlichen Vektoren für Leishmanien-Arten, Protozoen-Parasiten, die ein breites Spektrum von Symptomen produzieren, die von Hautläsionen bis hin zu viszeraler Pathologie reichen. Die Entschlüsselung der Art der Vektor-Parasiten-Wechselwirkungen ist von primärer Bedeutung für ein besseres Verständnis der Leishmanie-Übertragung auf ihre Wirte. Unter den Parametern, die die Sandfliegenvektorkompetenz steuern (d.h. ihre Fähigkeit, Krankheitserreger zu transportieren und zu übertragen), spielten parameter, die diesen Insekten innewohnen, eine Schlüsselrolle. Die Insektenimmunantwort zum Beispiel beeinflusst die Sandfliegenvektorkompetenz auf Leishmania. Die Untersuchung solcher Parameter wurde durch das Fehlen von Methoden zur Veränderung der Genexpression eingeschränkt, die für die Verwendung in diesen Nichtmodellorganismen angepasst wurden. Eine Gendownregulation durch kleine störende RNA (siRNA) ist möglich, aber neben der technischen Herausforderung führt das Silencing nur zu einem partiellen Funktionsverlust, der nicht von Generation zu Generation übertragen werden kann. Die gezielte Mutagenese durch CRISPR/Cas9-Technologie wurde kürzlich an die Phlebotomus papatasi Sandfliege angepasst. Diese Technik führt zur Erzeugung übertragbarer Mutationen in einem speziell ausgewählten Ort, der es ermöglicht, die genesweisend zu untersuchen. Das CRISPR/Cas9-System basiert auf der Induktion gezielter Doppelstrang-DNA-Breaks, die später entweder durch Non-Homologous End Joining (NHEJ) oder durch Homology Driven Repair (HDR) repariert werden. NHEJ besteht aus einem einfachen Abschluss der Pause und führt häufig zu kleinen Einfüge-/Löschereignissen. Im Gegensatz dazu verwendet HDR das Vorhandensein eines Spender-DNA-Moleküls, das Homologie mit der Ziel-DNA teilt, als Vorlage für die Reparatur. Hier präsentieren wir eine Sandfliegen-Embryo-Mikroinjektionsmethode zur gezielten Mutagenese von CRISPR/Cas9 mit NHEJ, der bisher einzigen Genommodifikationstechnik, die an Sandfliegenvektoren angepasst ist.
Introduction
Vektorübertragene Krankheiten stellen in ständiger Weiterentwicklung eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Hunderte von Vektorarten, die sich über sehr unterschiedliche phylogene Familien (z. B. Mücken, Zecken, Flöhe) verteilen, sind für die Übertragung einer großen Anzahl von mikrobiellen Krankheitserregern verantwortlich, was nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation zu mehr als 700.000 Todesfällen pro Mensch pro Jahr führt. Unter den Vektorinsekten bilden Phlebotomin-Sandfliegen (Diptera, Psychodidae) eine große Gruppe, mit 80 bewährten Vektorarten, die unterschiedliche phänotypische Merkmale und vektorielle Fähigkeiten aufweisen, die in verschiedenen geographischen Regionen zu finden sind. Sie sind Vektoren für die protozoischen Parasiten der Gattung Leishmania, verursacht etwa 1,3 Millionen neue Fälle von Leishmaniosen und zwischen 20.000 und 30.000 Todesfälle pro Jahr. Leishmaniose klinische Ergebnisse sind vielfältig, mit Symptomen, die von selbstbegrenzenden hautenden Läsionen bis hin zu viszeraler Verbreitung reichen, die in Ermangelung einer Behandlung tödlich ist.
Sandfliegen sind streng terrestrische Insekten. Ihr Lebenszyklus, relativ lang im Vergleich zu anderen Diptera, dauert bis zu drei Monate, abhängig von verschiedenen Parametern wie Temperatur, Feuchtigkeit, und Ernährung. Es besteht aus einem embryonalen Stadium (6 bis 11 Tage), vier Larvenstadien (insgesamt 23 bis 25 Tage) und einem Pupalstadium (9 bis 10 Tage) gefolgt von Metamorphose und dann Erwachsenwerden. Sandfliegen benötigen eine feuchte und warme Umgebung für die Aufzucht. Sowohl Männchen als auch Weibchen ernähren sich von Zucker, der in freier Wildbahn aus Blütennektaren gewonnen wird. Nur Weibchen sind Blutfütterer, da sie Proteine benötigen, die aus der Blutmahlzeit für die Eiproduktion gewonnen werden1.
Ein wichtiger Forschungsschwerpunkt ist die Identifizierung der Art der Vektor-Parasiten-Wechselwirkungen, die zur Entwicklung übertragbarer Infektionen führen. Wie bei anderen Vektorinsekten haben Parameter, die Sandfliegen innewohnen, gezeigt, dass sie ihre Vektorkompetenz beeinflussen, was als ihre Fähigkeit definiert ist, Krankheitserreger zu tragen und auf ihre Wirte zu übertragen. Zum Beispiel kann die Expression von Galektinen durch die Phlebotomus papatasi Sandfliegen-Mitteldarmzellen, die als Rezeptoren fungieren, die Parasitenoberflächenkomponenten erkennen, ihre Vektorkompetenz für Leishmania major2,3direkt beeinflussen. Der Immunantwortweg von Insekten, Immundeficiency (IMD), ist auch entscheidend für die Phlebotomus papatasi Sandfliegenvektor-Kompetenz für Leishmania major4. Eine entscheidende Rolle für Vektorinsekten Immunantwort Bahnen bei der Kontrolle ihrer Übertragung von infektiösen Krankheitserregern wurde ähnlich berichtet in Aedes aegypti Mücken5,6,7, in der Tsetse Fly Glossina morsitans8, und in Anopheles gambiae Mücken9,10.
Studien über Sandfliegen/Leishmanie-Wechselwirkungen wurden durch den Mangel an Methoden zur Modifikation der Genexpression, die für den Einsatz in diesen Insekten angepasst wurden, eingeschränkt. Bis vor kurzem wurdennur 11,12,13,14 durch kleine interferierende RNA (siRNA) durchgeführt. Die Technik, begrenzt durch die Mortalität im Zusammenhang mit der Mikroinjektion von erwachsenen Frauen, führt nur zu einem teilweisen Verlust der Funktion, die nicht von Generation zu Generation übertragen werden kann.
Die CRISPR/Cas9-Technologie hat die funktionelle Genomforschung bei Nicht-Modellorganismen wie Sandfliegen revolutioniert. Modifiziert vom adaptiven Immunsystem in Prokaryoten zur Abwehr von Bakteriophagen15,16, wurde das CRISPR Cas9-System schnell als Genom-Editing-Tool für überlegene eukaryotische Organismen, einschließlich Insekten, angepasst. Das Prinzip der gezielten Genombearbeitung von CRISPR/Cas9 basiert auf der Komplementarität einer einzelnen Führungs-RNA (sgRNA) zu einem bestimmten genomischen Ort. Die Cas9-Nuklease bindet an die sgRNA und erzeugt einen Doppelstrang-DNA-Bruch (dsDNA) in der genomischen DNA, bei dem die sgRNA mit ihrer komplementären Sequenz assoziiert. Der Cas9-sgRNA-Komplex wird durch 17 bis 20 komplementäre Basen in der sgRNA zum gewählten Ort zur Zielsequenz geführt, der dsDNA-Bruch kann dann durch zwei unabhängige Wege repariert werden: nichthomologe Endverbindung (NHEJ) oder homologiegesteuerte Reparatur (HDR)17. Die NHEJ-Reparatur beinhaltet einen einfachen Abschluss der Unterbrechung, führt aber häufig zu kleinen Einfüge-/Löschereignissen. DNA-Reparatur durch HDR verwendet ein Spender-DNA-Molekül, das Homologie mit der Ziel-DNA teilt, als Vorlage für die Reparatur. Insekten besitzen beide Maschinen.
Die CRISPR/Cas9-Technologie kann Mutationen in einem ausgewählten Ort über den NHEJ-Reparaturweg erzeugen; oder für komplexere Genom-Editing-Strategien, wie Knock-Ins oder Ausdrucksreporter, durch den HDR-Pfad mit einer geeigneten Spendervorlage. Bei Sandfliegen wurden null mutierte Allele des Immunantwortfaktors Relish durch NHEJ-vermittelte CRISPR in Phlebotomus papatasi4erzeugt. Sandfliegen-Embryonen wurden auch in einer anderen Studie mit einem CRISPR/Cas9-Mix injiziert, der auf das Gen abzielt, das Yellow kodiert. Dennoch wurden keine Erwachsenen mit der Mutationproduziert 18. Wir beschreiben hier eine detaillierte Methode der Sandfliegengezielten Mutagenese durch NHEJ-vermittelte CRISPR/Cas9, mit einem besonderen Fokus auf die Embryo-Mikroinjektion, ein kritischer Schritt des Protokolls.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir präsentieren hier eine kürzlich entwickelte Embryo-Mikroinjektionsmethode für gezielte Mutagenese von CRISPR/Cas9 in Phlebotomus papatasi Sandfliegen. Embryo-Mikroinjektion zur insektengenetischen Veränderung wurde Mitte der 1980er Jahre21 de Drosophila entwickelt und wird heute routinemäßig in einer Vielzahl von Insekten eingesetzt. Andere Methoden zur Lieferung von genetischen Veränderungsmaterialien wurden für den Einsatz in Insekten entwickelt, wie ReMOT<sup class…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Vanessa Meldener-Harrell für die kritische Lektüre des Manuskripts.
Materials
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
References
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