In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging zur Erforschung der Zellmigration zum Organ von Corti
Summary
In dieser Studie stellen wir ein Echtzeit-Bildgebungsverfahren unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie vor, um Zellen zu beobachten, die sich durch Ex-vivo-Inkubation mit dem Cochlea-Epithel, das das Organ von Corti enthält, in Richtung geschädigtes Gewebe bewegen.
Abstract
Um die Auswirkungen von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) auf die Zellregeneration und -behandlung zu untersuchen, verfolgt diese Methode MSC-Migration und morphologische Veränderungen nach Derkokultur mit Cochlea-Epithel. Das Organ von Corti wurde auf einem Kunststoffdeckel immobilisiert, indem ein Teil der Reissner-Membran gedrückt wurde, der während der Zerlegung erzeugt wurde. MSCs, die durch einen Glaszylinder begrenzt waren, migrierten zum Cochlea-Epithel, als der Zylinder entfernt wurde. Ihre vorherrschende Lokalisation wurde im Modiolus des Organs von Corti beobachtet, ähnlich ausgerichtet in eine Richtung, die der der Nervenfasern ähnelt. Einige MSCs wurden jedoch im Limbusbereich lokalisiert und zeigten eine horizontal längliche Form. Darüber hinaus wurde die Migration in den Haarzellbereich erhöht, und die Morphologie der MSCs änderte sich nach der Kanamycin-Behandlung in verschiedene Formen. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Studie darauf hin, dass die Kokultur von MSCs mit Cochlea-Epithel für die Entwicklung von Therapeutika durch Zelltransplantation und für Studien zur Zellregeneration nützlich sein wird, die verschiedene Bedingungen und Faktoren untersuchen können.
Introduction
Hörverlust kann angeboren auftreten oder kann schrittweise durch mehrere Faktoren verursacht werden, einschließlich Alterung, Medikamente, und Lärm. Hörverlust ist oft schwierig zu behandeln, weil es sehr schwierig ist, beeinträchtigte Funktion wiederherzustellen, sobald die für das Gehör verantwortlichen Haarzellen geschädigt sind1. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation leiden weltweit schätzungsweise 461 Millionen Menschen an Hörverlust, was 6,1 % der Weltbevölkerung ausmacht. Von den Menschen mit Hörverlust sind 93 % Erwachsene und 7 % Kinder.
Es wurde versucht, eine Reihe von Ansätzen zur Behandlung von Hörverlust zu finden; insbesondere hat sich ein Regenerationsansatz mit MsC als vielversprechende Behandlung herausgestellt. Wenn Gewebe geschädigt ist, werden MSCs natürlicherweise in das Kreislaufsystem freigesetzt und wandern an die Verletzungsstelle, wo sie verschiedene Moleküle absondern, um eine Mikroumgebung zu bilden, die die Regeneration fördert2. Daher ist es wichtig, eine Methode zur Behandlung von geschädigtem Gewebe durch die Migration von extern implantierten MSCs auf Zielorgane und deren anschließende Sekretion von Molekülen zu entwickeln, die eine starke Immunregulation, Angiogenese und Anti-Apoptose verursachen, um die Wiederherstellung der beschädigten Zellfunktion3,4,5zu verbessern.
Der Homing-Prozess, bei dem MSCs in beschädigte Gewebe migrieren, könnte das wichtigste Hindernis sein, das überwunden werden muss. MSCs verfügen über einen systemischen Homing-Mechanismus mit sequenziellen Schritten des Tethering/Rollings, der Aktivierung, des Arrests, der Transmigration/Diapedese und der Migration6,7,8. Derzeit werden Anstrengungen unternommen, um Wege zur Verbesserung dieser Schritte zu finden. Verschiedene Strategien, einschließlich genetischer Veränderung, Zelloberflächentechnik, In-vitro-Primierung und magnetische Rführung, wurden getestet6,7. Darüber hinaus wurden mehrere Versuche unternommen, den Schutz und die Regeneration von auditiven Haarzellen zu fördern, indem MSCs an die Stelle der beschädigten Cochlea homing. Die Verfolgung von MSCs in vivo ist jedoch zeitaufwändig und arbeitsintensiv und erfordert hochspezialisierte Fähigkeiten9.
Um dieses Problem zu lösen, wurde eine Methode entwickelt, um das Homing von MSCs in der Cochlea durch zeitraffende konfokale Mikroskopie zu beobachten, die die Migration von Zellen über mehrere Stunden fotografiert(Abbildung 1). Es wurde im frühen20. Jahrhundert entwickelt und hat sich vor kurzem zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Untersuchung der Migration von bestimmten Zellen.
Abbildung 1: Grafische Zusammenfassung. (A) Nachdem das sezierte Organ von Corti mit Zangen auf einem Kunststoffdeckel aufeinem Kunststoffdeckel aufkleben wird, wird der Deckelaufschub auf eine 35 mm Glasboden-Konfokalmikroskopische Schale gelegt, und (B) wird der Glaszylinder positioniert. (C) Nach dem Befüllen der Innenseite des Glaszylinders mit Medium(D) werden GFP-beschriftete MSCs mit Medium sorgfältig außerhalb des Zylinders hinzugefügt. (E) Nach der Inkubation über Nacht (F) wird der Glaszylinder entfernt und Die Bilder werden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen. Abkürzungen: GFP = grünes fluoreszierendes Protein; MSCs = mesenchymale Stammzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Transplantation von MSCs an beschädigten Stellen zur Förderung der Regeneration geschädigter Zellen wurde ausgiebig untersucht, und die therapeutische Wirkung ist offensichtlich. Die Transplantation und die anschließende Differenzierung von MSCs wurden berichtet, um das Gehör bei Ratten mit Hörverlust durch 3-Nitropropionsäure13induziert wiederherzustellen. Obwohl Lee et al. MSCs auf Menschen transvenös anwendeten, erreichten sie keine signifikante Verbesserung im Hören<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) der National Research Foundation (NRF) korea und hallym University Research Fund unterstützt.
Materials
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% Formalin | T&I | BPP-9004 | |
| Ampicillin | sigma | A5354-10ml | |
| BSA | sigma | A4503-100G | |
| confocal dish | SPL | 200350 | |
| confocal microscope | ZEISS | LSM800 | |
| coverslip | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher scientific | 16140071 | |
| Fluorsheild with DAPI | sigma | F6057 | |
| Forcep | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | Thermo Fisher scientific | 14065056 | |
| HEPES | Thermo Fisher scientific | 15630080 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Phalloidin-iFluor 647 Reagent | abcam | ab176759 | |
| Stage Top Incubator | TOKAI HIT | WELSX | |
| Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP | cyagen | MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | T8787 |
References
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