Utilisation de Grafix pour la détection des interacteurs transitoires des sous-complexes de Spliceosomes de Saccharomyces cerevisiae

Summary

Ici, nous décrivons l’utilisation de Grafix (Gradient Fixation), une centrifugation de gradient de glycérol en présence d’un réticulateur, pour identifier les interactions entre les facteurs d’épissage qui se lient transitoirement au complexe d’épissage.

Abstract

L’épissage pré-ARNm est un processus très dynamique qui implique de nombreux réarrangements moléculaires des sous-complexes spliceosomes lors de l’assemblage, du traitement de l’ARN et de la libération des composants complexes. La centrifugation du gradient de glycérol a été utilisée pour la séparation de complexes protéiques ou RNP (RiboNucleoProtein) pour des études fonctionnelles et structurelles. Ici, nous décrivons l’utilisation de Grafix (Gradient Fixation), qui a d’abord été développé pour purifier et stabiliser les complexes macromoléculaires pour la cryo-microscopie électronique à particule unique, afin d’identifier les interactions entre les facteurs d’épissage qui se lient transitoirement au complexe spliceosome. Cette méthode est basée sur la centrifugation d’échantillons en une concentration croissante d’un réactif de fixation pour stabiliser les complexes. Après centrifugation d’extraits totaux de levure chargés sur des gradients de glycérol, les fractions récupérées sont analysées par transfert de points pour l’identification des sous-complexes de spliceosomes et la détermination de la présence de facteurs d’épissage individuels.

Introduction

L’épissage est un processus très dynamique qui nécessite la liaison et la libération d’une multitude de facteurs de manière coordonnée. Ces facteurs d’épissage comprennent les protéines de liaison à l’ARN, les ATPases, les hélicases, les protéines kinases et les phosphatases, les ligas d’ubiquitine, entre autres^1,2,3; et pour permettre aux réarrangements moléculaires d’avoir lieu, certains de ces facteurs se lient très transitoirement aux sous-complexes spliceosomes, ce qui rend l’isolement et l’identification de ces complexes intermédiaires RNP très difficiles.

Ici, nous avons utilisé la méthode Grafix^4,5 pour stabiliser l’interaction du facteur d’épissage de levure Cwc24 avec le complexe^d’acte B⁶ afin de permettre l’identification d’autres facteurs liés concomitamment à ce sous-complexe et de déterminer si l’ubiquitine ligase Prp19 joue un rôle dans la liaison ou la libération de Cwc24 au complexe Nineteen (NTC) et à l’extrémité 5′ de l’intron avant l’activation et la première réaction de transestérification prend lieu. L’avantage d’exposer les macromolécules à une concentration croissante du réticulant le long du gradient de glycérol est qu’il évite les réticulations inter-complexes^4,5, et donc, la formation d’agrégats.

Cette méthode a été utilisée en complément de la coimmunoprécipitation des protéines et des essais de traction vers le bas, qui, bien que permettant l’isolement de grands complexes, peuvent ne pas être fiables pour maintenir les interactions transitoires au sein de grands complexes dynamiques^7,8. L’utilisation de réactifs de fixation dans le gradient de glycérol stabilise la liaison de ces facteurs, permettant la confirmation des interactions de protéines spécifiques avec des sous-complexes d’épissage. Parce que le réticulateur choisi était chimiquement irréversible, les protéines présentes dans les fractions récupérées ont été analysées par transfert de points après la centrifugation du gradient.

Protocol

1. Préparation de l’extrait total de levure Cultiver les cellules de levure exprimant l’un des facteurs d’épissage fusionnés à la balise TAP9 dans un milieu YNB-glu de 1 L (base d’azote de levure complétée par 2% m/v de glucose) avec les acides aminés ou les bases nucléiques appropriés, dans ce cas, l’adénine (20 μg/mL), la leucine (30 μg/mL), le tryptophane (30 μg/mL), jusqu’à OD600 = 1,0. Prélever les cellules de la culture 1 L en centrif…

Representative Results

Pour analyser le profil de sédimentation de Cwc24-TAP et déterminer si la méthode Grafix était efficace pour stabiliser sa liaison aux sous-complexes d’épissage, nous avons séparé des extraits de levure totaux de cellules exprimant Cwc24-TAP par centrifugation sur des gradients de glycérol, en présence ou en l’absence de glutaraldéhyde comme agent de réticulation. Des échantillons de vingt-quatre fractions de 500 μL ont ensuite été analysés par transfert de fente avec anticorps contre la partie CBP de…

Discussion

Les interactions protéine-protéine et acides ribonucléiques-protéines peuvent être stabilisées à l’aide d’agents de réticulation. Il est important que le complexe résultant soit stable pour résister à l’ultracentrifugation sur le gradient de glycérol. De plus, les conditions de tampon doivent permettre l’interaction, mais être suffisamment strictes pour éviter une liaison non spécifique. Dans les expériences présentées ici, nous avons utilisé une solution tampon déjà établie pour les réacti…

Materials

Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope	Millipore	07-482
ECL anti-Rabbit IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
Fraction Recovery System	Beckman Coulter	270-331580	Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem
Gradient Master Model 107ip	Biocomp	107-201M
Mixer Mill MM 200	Retsch	207460001	Ball Mill device
Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	36-101-0816
Swinging Bucket Rotor P40ST	Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX	Hitachi	901069
Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)	Beckman Coulter	344059