Utilizzo di Grafix per la rilevazione di interattori transitori di sottocomplessi di saccharomyces cerevisiae spliceosomi

Summary

Qui, descriviamo l’utilizzo di Grafix (Gradient Fixation), una centrifugazione a gradiente di glicerolo in presenza di un reticolante, per identificare le interazioni tra fattori di splicing che si legano transitoriamente al complesso spliceosoma.

Abstract

Lo splicing pre-mRNA è un processo molto dinamico che coinvolge molti riarrangiamenti molecolari dei sottocomplessi dello spliceosoma durante l’assemblaggio, l’elaborazione dell’RNA e il rilascio dei componenti complessi. La centrifugazione a gradiente di glicerolo è stata utilizzata per la separazione di complessi proteici o RNP (RiboNucleoProtein) per studi funzionali e strutturali. Qui, descriviamo l’utilizzo di Grafix (Gradient Fixation), che è stato sviluppato per la prima volta per purificare e stabilizzare i complessi macromolecolari per la microscopia crioeletnica a singola particella, per identificare le interazioni tra i fattori di splicing che si legano transitoriamente al complesso spliceosoma. Questo metodo si basa sulla centrifugazione di campioni in una concentrazione crescente di un reagente di fissazione per stabilizzare i complessi. Dopo la centrifugazione degli estratti totali di lievito caricati su gradienti di glicerolo, le frazioni recuperate vengono analizzate mediante dot blot per l’identificazione dei sotto-complessi spliceosomiali e la determinazione della presenza di singoli fattori di splicing.

Introduction

Lo splicing è un processo altamente dinamico che richiede il legame e il rilascio di una moltitudine di fattori in modo coordinato. Questi fattori di splicing includono proteine leganti l’RNA, ATPasi, elicasi, protein chinasi e fosfatasi, ubiquitina ligases, tra gli altri^1,2,3; e per consentire i riarrangiamenti molecolari, alcuni di questi fattori si legano molto transitoriamente ai sottocomplessi dello spliceosoma, rendendo molto impegnativo l’isolamento e l’identificazione di questi complessi intermedi RNP.

Qui, abbiamo usato il metodo Grafix^4,5 per stabilizzare l’interazione del fattore di splicing del lievito Cwc24 con il complesso di^atto B⁶ per consentire l’identificazione di altri fattori legati contemporaneamente a quel sottocomplesso e determinare se l’ubiquitina ligasi Prp19 svolge un ruolo nel legame o nel rilascio di Cwc24 al complesso Nineteen (NTC) e all’estremità 5′ dell’intron prima dell’attivazione e della prima reazione di transesterificazione prende luogo. Il vantaggio di esporre le macromolecole ad una concentrazione crescente del reticolante lungo il gradiente glicerolo è che evita i collegamenti incrociati inter-complessi^4,5e quindi, la formazione di aggregati.

Questo metodo è stato utilizzato come complemento ai saggi di coimmunoprecipitazione e pull-down proteici, che, pur consentendo l’isolamento di grandi complessi, potrebbero non essere affidabili per mantenere interazioni transitorie all’interno di grandi complessi^{dinamici 7,8}. L’uso di reagenti di fissazione nel gradiente del glicerolo stabilizza il legame di tali fattori, consentendo la conferma delle interazioni di proteine specifiche con sottocomplessi di splicing. Poiché il reticolante scelto era chimicamente irreversibile, le proteine presenti nelle frazioni recuperate sono state analizzate mediante dot blot dopo la centrifugazione a gradiente.

Protocol

1. Preparazione dell’estratto totale di lievito Crescono le cellule di lievito esprimendo uno dei fattori di splicing fusi al TAP tag9 in 1 L YNB-glu media (Yeast Nitrogen Basis integrato con glucosio 2% m/v) con gli aminoacidi o le basi nucleiche appropriate, in questo caso adenina (20 μg/mL), leucina (30 μg/mL), triptofano (30 μg/mL), fino a OD600 = 1,0. Raccogliere le cellule dalla coltura da 1 L centrifugando in tre flaconi di centrifuga da 500 mL a 17.000 x <…

Representative Results

Per analizzare il profilo di sedimentazione di Cwc24-TAP e determinare se il metodo Grafix fosse efficace per stabilizzare il suo legame ai sottocomplessi di splicing, abbiamo separato estratti di lievito totali di cellule che esprimono Cwc24-TAP attraverso centrifugazione su gradienti di glicerolo, in presenza o assenza di glutaraldeide come agente reticolante. Campioni di ventiquattro frazioni da 500 μL sono stati poi analizzati mediante slot blot con anticorpo contro la porzione CBP del tag TAP. I risultati mostrano …

Discussion

Le interazioni proteina-proteina e acidi ribonucleici-proteina possono essere stabilizzate utilizzando agenti reticolanti. È importante che il complesso risultante sia stabile per resistere all’ultracentrifugazione sul gradiente di glicerolo. Inoltre, le condizioni del buffer dovrebbero consentire l’interazione, ma essere abbastanza rigorose da evitare binding non specifici. Negli esperimenti qui mostrati, abbiamo utilizzato una soluzione tampone già stabilita per le reazioni di splicing in vitro^15</s…

Materials

Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope	Millipore	07-482
ECL anti-Rabbit IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
Fraction Recovery System	Beckman Coulter	270-331580	Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem
Gradient Master Model 107ip	Biocomp	107-201M
Mixer Mill MM 200	Retsch	207460001	Ball Mill device
Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	36-101-0816
Swinging Bucket Rotor P40ST	Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX	Hitachi	901069
Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)	Beckman Coulter	344059