अंकुरण रक्त वाहिकाओं का अध्ययन करने के लिए टेसेलेटेड मचान पर स्टेपवाइज सेल सीडिंग
Summary
इंजीनियर ऊतक महत्वपूर्ण पोषक तत्वों और गैसों को प्रदान करने और मेटाबोलिक कचरे को हटाने के लिए उचित संवहनी नेटवर्क पर भारी भरोसा करते हैं। इस काम में, एंडोथेलियल कोशिकाओं और समर्थन कोशिकाओं का एक स्टेपवाइज सीडिंग प्रोटोकॉल नियंत्रित 3 डी वातावरण में विकासशील पोत व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट मंच में अत्यधिक संगठित संवहनी नेटवर्क बनाता है।
Abstract
हृदय प्रणाली मानव शरीर विज्ञान में एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी है, जो शरीर में अधिकांश ऊतकों को पोषण प्रदान करती है; प्रत्येक विशिष्ट छिद्रित ऊतक के आधार पर जहाज विभिन्न आकारों, संरचनाओं, फेनोटाइप और प्रदर्शन में मौजूद होते हैं। ऊतक इंजीनियरिंग का क्षेत्र, जिसका उद्देश्य क्षतिग्रस्त या लापता शरीर के ऊतकों की मरम्मत या प्रतिस्थापित करना है, इंजीनियर ऊतकों के भीतर एक उचित संवहनी बनाने के लिए नियंत्रित एंजियोजेनेसिस पर निर्भर करता है। एक संवहनी प्रणाली के बिना, मोटी इंजीनियर निर्माण पर्याप्त रूप से पोषित नहीं किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप सेल मृत्यु, खराब एनग्रेफ्टमेंट और अंततः विफलता हो सकती है। इस प्रकार, इंजीनियर रक्त वाहिकाओं के व्यवहार को समझना और नियंत्रित करना क्षेत्र में एक उत्कृष्ट चुनौती है। यह काम एक उच्च थ्रूपुट प्रणाली प्रस्तुत करता है जो 3 डी पाड़ वातावरण में पोत व्यवहार का अध्ययन करने के लिए संगठित और दोहराने योग्य पोत नेटवर्क के निर्माण की अनुमति देता है। इस दो कदम सीडिंग प्रोटोकॉल से पता चलता है कि प्रणाली के भीतर जहाजों पाड़ स्थलाकृति पर प्रतिक्रिया, डिब्बे ज्यामिति जिसमें जहाजों रहते है के आधार पर विशिष्ट अंकुरण व्यवहार पेश । इस उच्च थ्रूपुट प्रणाली से प्राप्त परिणामों और समझ को बेहतर 3 डी बायोप्रिंटेड पाड़ निर्माण डिजाइनों को सूचित करने के लिए लागू किया जा सकता है, जिसमें सेलुलरीकृत जैविक वातावरण के आधार के रूप में 3 डी प्रिंटिंग का उपयोग करते समय विभिन्न 3 डी ज्यामिति के निर्माण का तेजी से आकलन नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, इस उच्च थ्रूपुट प्रणाली से समझ का उपयोग तेजी से दवा स्क्रीनिंग के सुधार, सह-संस्कृतियों के मॉडलों के तेजी से विकास और संवहनी प्रणाली के ज्ञान को गहरा करने के लिए रक्त वाहिका गठन पर यांत्रिक उत्तेजनाओं की जांच के लिए किया जा सकता है।
Introduction
टिश्यू इंजीनियरिंग का क्षेत्र लापता या क्षतिग्रस्त अंगों और ऊतकों को बदलने के लिए इंजीनियर निर्माणों के निर्माण की दिशा में तेजी से प्रगति कर रहा है1. हालांकि, पूरी तरह से कार्यात्मक निर्माण अभी तक प्राप्त किया जाना है, भाग में, ऊतक पोषण के लिए परिचालन संवहनी नेटवर्क पैदा करने के बाद से एक उत्कृष्ट चुनौती बनी हुई है । उचित संवहनी के बिना, इंजीनियर ऊतक ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के निष्क्रिय प्रसार परिवहन तक सीमित हैं, जो अधिकतम व्यवहार्य ऊतक मोटाई को प्रसार सीमा तक बाधित करते हैं, लगभग 200 माइक्रोन2। इस तरह की मोटाई बड़े ऊतक दोषों की मरम्मत या पूर्ण अंग निर्माण के लिए उपयुक्त नहीं हैं, जो कार्यात्मक संवहनी नेटवर्क की उपस्थिति को कार्यात्मक और प्रत्यारोपित ऊतकों के लिए एक अनिवार्य विशेषता प्रदान करता है3।
संवहनी प्रणाली में विभिन्न आकारों, फेनोटाइप और संगठन के साथ विभिन्न प्रकार की रक्त वाहिकाओं शामिल हैं, जो मेजबान ऊतक से कसकर संबंधित हैं। विकासशील और अंकुरित जहाजों द्वारा किए गए व्यवहार, प्रतिक्रिया और प्रवासन निर्णयों को समझना इंजीनियर ऊतकों में उनके एकीकरण का निर्देश दे सकता है4। वर्तमान में, इन विट्रो वैस्कुलर नेटवर्क बनाने के लिए सबसे आम दृष्टिकोण त्रि-आयामी सूक्ष्म वातावरण के भीतर वरीयता प्राप्त, भित्ति कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता के साथ समर्थन कोशिकाओं (एससी) के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं (एनसी) का संयोजन है। यह वातावरण कोशिकाओं को पोत नेटवर्क2, 5, 6, 7, 8में संलग्न, प्रसार और स्वयं को इकट्ठा करने की अनुमति देनेकेलिए रासायनिक और भौतिक संकेत प्रदान करता है। जब सह-संस्कारी, एससी ईसी को यांत्रिक सहायता प्रदान करते हुए बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन का स्राव करते हैं, जो ट्यूबलर संरचनाओं का निर्माण करते हैं। इसके अलावा, दोनों सेल प्रकारों के बीच एक क्रॉस-इंटरैक्शन ट्यूबुलोजेनेसिस, पोत अंकुरण और प्रवासन को बढ़ावा देता है, अनुसूचित जाति परिपक्वता और α-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन-एक्सप्रेसिंग (αSMA) भित्ति कोशिकाओं में भेदभाव के अलावा4। पोत नेटवर्क विकास का सबसे अधिक अध्ययन हाइड्रोगेल, असुरक्षित बहुलक मचान, या उसके संयोजन का उपयोग करके बनाए गए 3 डी वातावरण में किया जाता है। उत्तरार्द्ध विकल्प समान रूप से सेल-अनुकूल वातावरण और कोशिकाओं और ईसीएम9दोनों के लिए आवश्यक यांत्रिक सहायता प्रदान करता है।
संवहनी विकास का अध्ययन करने के लिए काफी काम किया गया है, जिसमें हाइड्रोगेल10,हाइड्रोगेल्स-पाड़ संयोजन11, 12,2डीप्लेटफार्मों और माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों13पर कोशिकाओं को सह-खेती करना शामिल है। हालांकि, हाइड्रोगेल को सेल-डालती बलों द्वारा आसानी से विकृत किया जा सकताहै,जबकि 2डी और माइक्रोफ्लुइडिक्स सिस्टम अधिक एक्सट्रपलेबल प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए प्रकृति के करीब वातावरण को फिर से बनाने में विफलरहतेहैं15,16। यह समझना कि जहाजों को उनके आसपास के वातावरण पर कैसे प्रतिक्रिया देनी महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सकती है जो एक उम्मीद के मुताबिक तरीके से पोत के विकास का मार्गदर्शन करने की क्षमता के साथ इंजीनियर वातावरण के निर्माण के लिए अनुमति दे सकती है। संवहनी गठन की घटनाओं को समझना विशेष रूप से सबमिक्र-टू-माइक्रोन स्केल फैब्रिकेशन तकनीकों के तेजी से उद्भव के साथ तालमेल रखने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे स्टीरियोलिथोग्राफी, डिजिटल प्रोजेक्शन लिथोग्राफी, निरंतर तरल इंटरफेस उत्पादन, 3 डी मेल्ट-इलेक्ट्रो जेटराइटिंग, समाधान आधारित 3डी इलेक्ट्रो जेट लेखन, और उभरती बायोप्रिंटिंग तकनीक17,18,19,20,21। संवहनी जीव विज्ञान की गहरी समझ के साथ इन माइक्रोमैन्यूफैक्चरिंग तकनीकों के नियंत्रण को संरेखित करना एक लक्ष्य ऊतक के लिए एक उपयुक्त इंजीनियर वैक्यूलेचर के निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है।
यहां, हम आसपास के पाड़ ज्यामिति के लिए नए बनाने और अंकुरण जहाजों की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक 3 डी प्रणाली पेश करते हैं, उनके अंकुरित मूल और बाद में प्रवास22देख रहे हैं। टेसेलेटेड डिब्बे ज्यामिति, और दो-चरण सीडिंग तकनीक के साथ 3 डी मचानों का उपयोग करके, हम फैशन का विश्लेषण करने के लिए एक स्पष्ट और आसान में अत्यधिक संगठित संवहनी नेटवर्क बनाने में सफल रहे। टेसेलेटेड ज्यामिति एक उच्च थ्रूपुट प्रणाली प्रदान करती है जिसमें जहाजों वाले अलग-अलग इकाइयां होती हैं जो उनके स्थानीय पर्यावरण का जवाब देती हैं। बहुरंगी ECs का उपयोग करते हुए, हमने अंकुरित गठन मूल और बाद में माइग्रेशन पैटर्न को ट्रैक किया, जो डिब्बे ज्यामिति और एससी स्थान22से सहसंबद्ध था।
यद्यपि प्रस्तावित प्रोटोकॉल संवहनी व्यवहार पर ज्यामितीय संकेतों के प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए तैयार किया गया है, इस दृष्टिकोण का विस्तार किया जा सकता है और विभिन्न नए अनुप्रयोगों पर लागू किया जा सकता है। टेसेलेटेड पाड़ और आसानी से इमेज करने योग्य नेटवर्क विभिन्न ईसीएस और एससी इंटरैक्शन के सीधे विश्लेषण, विशिष्ट अंग कोशिकाओं के अलावा और संवहनी नेटवर्क के साथ उनकी बातचीत, संवहनी नेटवर्क पर दवा प्रभाव, और अधिक के लिए अनुमति देते हैं। हमारे सुझाए गए सिस्टम के परिणाम बहुत बहुमुखी और सरल निर्माण और प्रसंस्करण के हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इंजीनियर ऊतकों में एम्बेडेड के भीतर एक समृद्ध वैक्यूलेचर की आवश्यकता जीवित रहने और उचित कार्य के निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है1. हालांकि संवहनी प्रणाली इंजीनियरिंग अनुसंधान की एक विशाल राशि ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को मिशिगन विश्वविद्यालय-अनुसंधान के लिए इज़राइल पार्टनरशिप से वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक उड़ी मेर्डलर, लिओर डेबी और गैलिया बेन डेविड को उनकी महान सहायता और समर्थन, नाडीन वांग, पीएचडी और पिलर हेरेरा-फिएरो, मिशिगन विश्वविद्यालय में लुरी नैनोफैब्रिकेशन सुविधा के पीएचडी के साथ-साथ फोटोलिथोग्राफी तकनीकों की ज्ञानवर्धक चर्चाओं के लिए लुइस सोलोरियो, पीएचडी का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।
Materials
| Angiotool freeware | NIH-CCR | Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| Evicel fibrin sealant | Johnson&Johnson | EVB05IL | Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 | Thermo- Fisher Scientific | A11034 | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | Stock concentration: 1 mg/mL |
| ImageJ | NIH | Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isopropyl alcohol | Gadot-Group | 67-63-0 | |
| Lift-off reagent | Kayaku Advanced Materials, Inc | G112850 | Commercial name Omnicoat |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Rabbit anti-vWF antibody | Abcam | ab9378 | |
| Silicon wafer | Silicon Valley Microelectronics (SVM) | Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick | |
| SU-8 2050 photoresist | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y11058 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y020100 | |
| Tryton-X 100 | BioLab LTD | 57836 |
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