発芽血管を研究するためのテッセレーション足場の段階的な細胞播種
Summary
設計された組織は、重要な栄養素やガスを提供し、代謝廃棄物を除去するために適切な血管ネットワークに大きく依存しています。この研究では、内皮細胞と支持細胞の段階的な播種プロトコルにより、制御された3D環境における血管挙動の開発を研究するための高スループットプラットフォームで、高度に組織化された血管ネットワークを作成する。
Abstract
心血管系は、人間の生理学の重要なプレーヤーであり、体内のほとんどの組織に栄養を提供します。血管は、各特定の浸透組織に応じて異なるサイズ、構造、フェノタイプ、および性能で存在する。損傷または欠けている身体組織の修復または置き換えを目的とする組織工学の分野は、制御された血管新生に依存して、設計された組織内で適切な血管導入を生み出す。血管系がなければ、厚い工学的な構造は十分に栄養を与えられず、細胞死、生着不良、そして最終的には失敗を引き起こし得る。このように、操作された血管の挙動を理解し、制御することは、この分野における顕著な課題です。この研究は、3D足場環境における船舶行動を研究するための組織的かつ繰り返し可能な船舶ネットワークの作成を可能にするハイスループットシステムを提示する。この2段階のシーディングプロトコルは、システム内の血管が足場地形に反応し、血管が存在する区画形状に応じて独特の発芽動作を示すことを示しています。この高スループットシステムから得られた結果と理解は、より良い3Dバイオプリント足場構築設計を知らせるために適用することができ、細胞化された生物学的環境の基礎として3Dプリンティングを使用する場合、様々な3Dジオメトリの製造を迅速に評価することはできません。さらに、この高スループットシステムからの理解は、迅速な薬物スクリーニングの改善、共培養モデルの急速な開発、血管形成に関する機械的刺激の検討を行い、血管系の知識を深めるために利用することができる。
Introduction
組織工学の分野は、欠損または損傷した器官および組織を置き換えるために設計された構造の製造に向けて急速に進んでいる1.しかし、組織の栄養のための運用血管ネットワークを生成することは依然として顕著な課題であるため、完全に機能する構造はまだ達成されていません。適切な血管化がなければ、工学的組織は酸素および栄養素の受動的拡散輸送に限定され、最大生存可能な組織厚さを拡散限界まで拘束し、約200μm2。このような厚みは、大きな組織欠損を修復したり、機能的および埋め込み型組織に必須の特性を機能的な血管ネットワークの存在をレンダリングする全臓器製造のためには適していない。
血管系は、多種多様な血管から構成され、サイズ、型、組織が異なり、宿主組織と密接に関連している。開発船と発芽船によって行われた行動、応答および移行の決定を理解することは、設計された組織4におけるそれらの統合を指示することができる。現在、インビトロ血管ネットワークを作成するための最も一般的なアプローチは、3次元のマイクロ環境内に播種された内皮細胞(EC)と支持細胞(SC、壁画細胞に分化する能力)を組み合わせることです。この環境は、細胞が血管ネットワーク2、5、6、7、8に接続し、増殖し、自己組み立てできるように、化学的および物理的な手がかりを提供します。共同培養すると、SCは細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を分泌すると同時に、管状構造を形成するECsに機械的なサポートを提供します。さらに、両細胞型間の交差相互作用は、管切垂、血管発芽および遊走を促進し、SCの成熟およびα平滑筋アクチン発現(αSMA)壁画細胞への分化に加えて4。血管ネットワークの開発は、ヒドロゲル、多孔質ポリマー足場、またはその組み合わせを使用して作成された3D環境で最も一般的に研究されています。後者のオプションは、セルに優しい環境と、セルと ECM9の両方に必要な機械的サポートを提供します。
ヒドロゲル10上の細胞を共培養する、ヒドロゲルス足場の組み合わせ11、12、2Dプラットフォーム、およびマイクロ流体デバイス13を含む血管発達を研究するために多量の作業が行われている。しかし、ヒドロゲルは細胞力14によって容易に変形することができるが、2Dおよびマイクロ流体システムは、より近い自然環境を再現できず、より外界的な応答15、16を得る。形成容器が周囲の環境にどのように反応するかを理解することは、予測可能な方法で血管の開発を導く能力を備えたエンジニアリングされた環境の製造を可能にする重要な洞察を提供することができます。血管形成現象を理解することは、ステレオリソグラフィ、デジタル投影リソグラフィ、連続液体界面生産、3Dメルトエレクトロジェットライティング、ソリューションベースの3Dエレクトロジェット書き、および新しいバイオプリンティング技術17、18、19、20、21などのサブミクロンからミクロンへのスケール製造技術の急速な出現に追いつくために特に重要である。これらのマイクロマニュファクチャリング技術の制御を血管生物学の深い理解と整合させることは、標的組織に対する適切な工学的血管構造の作成の鍵となる。
ここでは、周囲の足場幾何学に対する新しい形成および発芽容器の応答を研究し、その芽発生とその後の移行22を観察する3Dシステムを提示する。テッセレーションコンパートメントの形状を持つ3Dスキャフォールドと2段階のシード技術を駆使し、明確で簡単に解析できる血管ネットワークを作り出すことに成功しました。テッセレーションされたジオメトリは、ローカル環境に応答する容器を含む個々のユニットで高スループットシステムを提供します。多色の IC を使用して、スプラウトの形成の原点とその後の移行パターンを追跡し、コンパートメント ジオメトリと SC 位置22と相関しました。
提案されたプロトコルは、幾何学的手がかりが血管化行動に及ぼす影響を分析するために準備されているが、このアプローチは拡大され、様々な新しいアプリケーションに適用することができる。テッセレーションされた足場と容易にイメージ可能なネットワークは、異なるICおよびSC相互作用の簡単な分析、特定の器官細胞の追加および血管ネットワークとの相互作用、血管ネットワークへの薬物効果などを可能にする。私たちの提案されたシステムの結果は非常に多目的で、簡単な製造および処理の。
Protocol
Representative Results
Discussion
設計された組織に埋め込まれた中で豊かな血管系の必要性は、構築の生存と適切な機能1のために重要です。血管系のエンジニアリングは膨大な研究の焦点となってきましたが、24を調査して理解するために多くが残されています。特に、特定の組織を再作成する場合、マイクロバスキュアチュアは12に応じて動作し、整理する必要があり?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ミシガン大学- イスラエル研究パートナーシップからの資金によって支えられました。著者らは、ウリ・メルドラー、リオール・デビ、ガリア・ベン・デイビッドの大きな支援と支援、ミシガン大学ルーリー・ナノファブリケーション・ファシリティのナディーン・ワン博士とピラール・エレーラ・フィエロ博士、ルイス・ソロリオ博士のフォトリソグラフィー技術の議論に感謝したいと考えています。
Materials
| Angiotool freeware | NIH-CCR | Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| Evicel fibrin sealant | Johnson&Johnson | EVB05IL | Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 | Thermo- Fisher Scientific | A11034 | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | Stock concentration: 1 mg/mL |
| ImageJ | NIH | Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isopropyl alcohol | Gadot-Group | 67-63-0 | |
| Lift-off reagent | Kayaku Advanced Materials, Inc | G112850 | Commercial name Omnicoat |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Rabbit anti-vWF antibody | Abcam | ab9378 | |
| Silicon wafer | Silicon Valley Microelectronics (SVM) | Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick | |
| SU-8 2050 photoresist | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y11058 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y020100 | |
| Tryton-X 100 | BioLab LTD | 57836 |
References
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
- Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
- Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
- Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
- Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
- Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
- Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
- Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
- Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. Bio-ingénierie. 7 (1), (2020).
- Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
- Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).
- Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
- Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).
- Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
- Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).
- Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).
- Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
- Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
- Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
- Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
- Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
- Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
- Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
- Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
- Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
- Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5 (2016).
- van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
- Nguyen, D. -. H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
- Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185 (2017).
