Пошаговый посев клеток на тесселлированных каркасах для изучения прорастающего кровеносного сосуда
Summary
Инженерные ткани в значительной степени полагаются на правильные сосудистые сети для обеспечения жизненно важных питательных веществ и газов и удаления метаболических отходов. В этой работе протокол поэтапного посева эндотелиальных клеток и поддерживающих клеток создает высокоорганизованные сосудистые сети на высокопроизводительной платформе для изучения развития поведения сосудов в контролируемой 3D-среде.
Abstract
Сердечно-сосудистая система является ключевым игроком в физиологии человека, обеспечивая питание большинства тканей в организме; сосуды присутствуют в разных размерах, структурах, фенотипах и производительности в зависимости от каждой конкретной перфузированной ткани. Область тканевой инженерии, которая направлена на восстановление или замену поврежденных или отсутствующих тканей организма, опирается на контролируемый ангиогенез для создания правильной васкуляризации в инженерных тканях. Без сосудистой системы толстые инженерные конструкции не могут быть достаточно питательными, что может привести к гибели клеток, плохому приживлению и, в конечном счете, к отказу. Таким образом, понимание и контроль поведения инженерных кровеносных сосудов является выдающейся проблемой в этой области. В данной работе представлена высокопроизводительная система, позволяющая создавать организованные и воспроизводимые сети судов для изучения поведения судна в среде 3D-лесов. Этот двухэтапный протокол посева показывает, что сосуды в системе реагируют на топографию каркаса, представляя отличительные поведения прорастающего в зависимости от геометрии отсека, в котором находятся сосуды. Полученные результаты и понимание этой высокопроизводительной системы могут быть применены для того, чтобы информировать о лучших конструкциях 3D-биопечатных каркасов, в которых изготовление различных 3D-геометрий не может быть быстро оценено при использовании 3D-печати в качестве основы для клеточных биологических сред. Кроме того, понимание этой высокопроизводительной системы может быть использовано для улучшения быстрого скрининга лекарств, быстрого развития моделей кокультур и исследования механических стимулов на образование кровеносных сосудов для углубления знаний о сосудистой системе.
Introduction
Область тканевой инженерии быстро прогрессирует в направлении изготовления инженерных конструкций для замены отсутствующих или поврежденных органов и тканей1. Тем не менее, полностью функциональные конструкции еще не достигнуты, отчасти потому, что создание операционных сосудистых сетей для питания тканей остается нерешенной проблемой. Без надлежащей васкуляризации инженерные ткани ограничиваются пассивным диффузионным транспортом кислорода и питательных веществ, ограничивая максимальную жизнеспособную толщину ткани до предела диффузии, примерно 200мкм2. Такие толщины не подходят для восстановления крупных дефектов тканей или для полного изготовления органов, что делает наличие функциональной сосудистой сети обязательным свойством для функциональных и имплантируемых тканей3.
Сосудистая система состоит из широкого спектра кровеносных сосудов с различными размерами, фенотипами и организацией, тесно связанными с тканью хозяина. Понимание поведения, реакции и миграционных решений, принимаемых развивающимися и прорастающими сосудами, может инструктировать их интеграцию в инженерныеткани 4. В настоящее время наиболее распространенным подходом к созданию сосудистых сетей in vitro является объединение эндотелиальных клеток (ЭК) с поддерживаючими клетками (СК, с возможностью дифференцировки в настенные клетки), посеянными в трехмерной микросреде. Эта среда обеспечивает химические и физические сигналы, позволяющие клеткам присоединяться, размножаться и самособираться в сосудистые сети2,5,6,7,8. При совместной культивации СК секретируют белки внеклеточного матрикса (ECM), обеспечивая механическую поддержку ЭК, которые образуют трубчатые структуры. Кроме того, перекрестное взаимодействие между обоими типами клеток способствует тубулогенезу, прорасти сосудов и миграции, в дополнение к созреванию и дифференцировке SCs в α гладкомышечные актин-экспрессирующие (αSMA) настенные клетки4. Развитие сети сосудов чаще всего изучается в 3D-средах, созданных с использованием гидрогелей, пористых полимерных каркасов или их комбинации. Последний вариант в равной степени обеспечивает дружественную к ячейкам среду и необходимую механическую поддержку как для ячеек, так и для ECM9.
Проведен большой объем работ по изучению сосудистого развития, включая совместное культивирование клеток на гидрогелях10,гидрогелях-каркасных комбинациях11,12, 2Dплатформах и микрофлюидных устройствах13. Однако гидрогели могут быть легко деформированы клеточнымисилами 14,в то время как 2D и микрофлюидные системы не могут воссоздать более близкую к природе среду для получения более экстраполяционируемого ответа15,16. Понимание того, как формирующиеся суда реагируют на окружающую их среду, может обеспечить критическое понимание, которое может позволить создать инженерные среды с возможностью предсказуемого руководства развитием судна. Понимание явлений сосудистого образования особенно важно, чтобы идти в ногу с быстрым появлением методов изготовления в масштабе субмикрона, таких как стереолитография, цифровая проекционная литография, непрерывное производство жидкого интерфейса, 3D-электроструйная запись, 3D-электроструйная запись на основе растворов и новые методы биопечати17,18,19,20,21. Согласование контроля этих методов микропроизводства с более глубокое понимание сосудистой биологии является ключом к созданию соответствующей инженерной сосудистой системы для ткани-мишени.
Здесь мы представляем 3D-систему для изучения реакции новых формирующихся и прорастающих сосудов на окружающую геометрию лесов, наблюдая за их происхождением ростков и последующей миграцией22. Используя 3D-каркасы с тесселяцией геометрии отсека и двухэтапную технику посева, нам удалось создать высокоорганизованные сосудистые сети четким и простым для анализа способом. Тесселяционная геометрия обеспечивает высокую пропускную способность системы с отдельными блоками, содержащими сосуды, которые реагируют на их локальную среду. Используя разноцветные ЭК, мы отслеживали происхождение образования ростков и последующие модели миграции, коррелировали с геометрией компартмента и расположением СК22.
Хотя предлагаемый протокол был подготовлен для анализа влияния геометрических сигналов на поведение васкуляризации, этот подход может быть расширен и применен к различным новым приложениям. Тесселлированный каркас и легко обизуемые сети позволяют проводить прямой анализ различных взаимодействий ЭК и СК, добавления специфических клеток органов и их взаимодействия с сосудистыми сетями, лекарственного воздействия на сосудистые сети и многого другого. Предлагаемая нам система имеет очень универсальные и простые результаты изготовления и обработки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Потребность в богатой сосудистой клетке внутри встроенных в инженерные ткани имеет решающее значение для выживания конструкции и правильной функции1. Хотя инженерия сосудистой системы была в центре внимания огромного количества исследований, многое осталось исследоват?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано финансированием Мичиганского университета – Израильского партнерства по исследованиям. Авторы хотели бы поблагодарить Ури Мердлера, Лиора Дебби и Галию Бен Дэвид за их большую помощь и поддержку, Надин Ванг, доктора философии, и Пилар Эррера-Фиерро, доктора философии Из Центра нанопроизводства Лурье в Мичиганском университете, а также Луиса Солорио, доктора философии, за просветительские дискуссии о методах фотолитографии.
Materials
| Angiotool freeware | NIH-CCR | Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| Evicel fibrin sealant | Johnson&Johnson | EVB05IL | Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 | Thermo- Fisher Scientific | A11034 | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | Stock concentration: 1 mg/mL |
| ImageJ | NIH | Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isopropyl alcohol | Gadot-Group | 67-63-0 | |
| Lift-off reagent | Kayaku Advanced Materials, Inc | G112850 | Commercial name Omnicoat |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Rabbit anti-vWF antibody | Abcam | ab9378 | |
| Silicon wafer | Silicon Valley Microelectronics (SVM) | Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick | |
| SU-8 2050 photoresist | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y11058 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y020100 | |
| Tryton-X 100 | BioLab LTD | 57836 |
References
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
- Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
- Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
- Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
- Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
- Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
- Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
- Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
- Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. Bio-ingénierie. 7 (1), (2020).
- Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
- Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).
- Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
- Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).
- Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
- Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).
- Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).
- Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
- Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
- Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
- Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
- Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
- Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
- Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
- Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
- Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
- Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5 (2016).
- van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
- Nguyen, D. -. H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
- Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185 (2017).
