Gonadektomie und Blutentnahmeverfahren im Small Size Teleost Modell Japanische Medaka (Oryzias latipes)
Summary
Der Artikel beschreibt ein schnelles Protokoll zur Gonadekttomisierung und Blutentnahme aus dem kleinen Teleostfisch, wobei japanische Medaka(Oryzias latipes)als Modell verwendet wird, um die Rolle von Sexualsteroiden in der Tierphysiologie zu untersuchen.
Abstract
Sexualsteroide, die von den Gonaden produziert werden, spielen eine wesentliche Rolle bei der Plastizität von Gehirn und Hypophysengewebe und bei der neuroendokrinen Kontrolle der Fortpflanzung bei allen Wirbeltieren, indem sie dem Gehirn und der Hypophyse Rückmeldung geben. Teleostfische besitzen im Vergleich zu Säugetieren einen höheren Grad an Gewebeplastizität und Variation der Fortpflanzungsstrategien und scheinen nützliche Modelle zu sein, um die Rolle von Sexualsteroiden und die Mechanismen, mit denen sie wirken, zu untersuchen. Die Entfernung der Hauptquelle der Sexualsteroidproduktion durch Gonadektomie zusammen mit Blutentnahme zur Messung des Steroidspiegels ist bei größeren Fischen gut etabliert und ziemlich machbar und ist eine leistungsstarke Technik, um die Rolle und Auswirkungen von Sexualsteroiden zu untersuchen. Diese Techniken werfen jedoch Herausforderungen auf, wenn sie in kleinen Teleostmodellen implementiert werden. Hier beschreiben wir die schrittweisen Verfahren der Gonadektomie sowohl bei Männern als auch bei weiblichen japanischen Medakas, gefolgt von Blutentnahmen. Diese Protokolle haben sich in Medaka als sehr praktikabel erwiesen, was durch eine hohe Überlebensrate, Sicherheit für die Lebensdauer und den Phänotyp der Fische und Reproduzierbarkeit in Bezug auf die Clearance von Sexualsteroiden angezeigt wird. Die Verwendung dieser Verfahren in Kombination mit den anderen Vorteilen der Verwendung dieses kleinen Teleostmodells wird das Verständnis der Rückkopplungsmechanismen bei der neuroendokrinen Kontrolle der Fortpflanzung und der Gewebeplastizität von Sexualsteroiden bei Wirbeltieren erheblich verbessern.
Introduction
Bei Wirbeltieren spielen Sexualsteroide, die hauptsächlich von den Gonaden produziert werden, eine wichtige Rolle bei der Regulation der Gehirn-Hypophysen-Gonaden-Achse (BPG) durch verschiedene Rückkopplungsmechanismen1,2,3,4,5. Darüber hinaus beeinflussen Sexualsteroide die Proliferation und Aktivität von Neuronen im Gehirn6,7,8 und endokrinen Zellen, einschließlich Gonadotropen, in der Hypophyse9,10und spielen somit eine entscheidende Rolle bei der Plastizität von Gehirn und Hypophyse. Trotz relativ guter Kenntnisse bei Säugetieren ist der Mechanismus der BPG-Achsenregulation, der durch Sexualsteroide vermittelt wird, bei Nicht-Säugetierarten weit davon entfernt, verstanden zu werden, was zu einem schlechten Verständnis der evolutionär konservierten Prinzipien führt11. Es gibt immer noch eine begrenzte Anzahl von Studien, die die Rolle von Sexualsteroiden auf die Plastizität von Gehirn und Hypophyse dokumentieren, was die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen der Rolle und der Auswirkungen von Sexualsteroiden auf verschiedene Wirbeltierarten erhöht.
Unter den Wirbeltieren sind Teleoste zu mächtigen Modelltieren geworden, die zahlreiche biologische und physiologische Fragen beantworten, einschließlich Stressreaktion12,13, Wachstum14,15, Ernährungsphysiologie16,17 und Fortpflanzung2. Teleosten, bei denen Sexualsteroide hauptsächlich durch Östradiol (E2) bei Weibchen und 11-Ketotestosteron (11-KT) bei Männchen18,19vertreten sind, sind seit langem zuverlässige experimentelle Modelle zur Untersuchung des allgemeinen Prinzips der Fortpflanzung über Arten hinweg. Teleoste zeigen Einzigartigkeit in ihrer Hypothalamus-Hypophysen-Verbindung20,21 und verschiedenen Gonadotropzellen22, die manchmal für die Aufklärung von Regulationsmechanismen geeignet sind. Darüber hinaus bieten Teleoste aufgrund ihrer Zugänglichkeit für Labor- und Feldexperimente viele Vorteile gegenüber anderen Organismen. Sie sind relativ kostengünstig in der Anschaffung und Wartung23,24. Insbesondere kleine Teleostmodelle wie Zebrafische (Danio rerio) und die japanische Medaka (Oryzias latipes) sind Arten mit sehr hoher Fruchtbarkeit und einem relativ kurzen Lebenszyklus, die eine schnelle Analyse der Genfunktion und Krankheitsmechanismen ermöglichen23, was angesichts der zahlreichen gut entwickelten Protokolle und des genetischen Toolkits, die für diese Arten verfügbar sind, noch größere Vorteile bei der Behandlung einer Vielzahl biologischer und physiologischer Fragen bietet25.
In zahlreichen Studien wurde die Entfernung von Gonaden (Gonadektomie) zusammen mit Blutentnahmetechniken als Methode zur Untersuchung vieler physiologischer Fragen verwendet, einschließlich ihrer Auswirkungen auf die Fortpflanzungsphysiologie von Wirbeltieren bei Säugetieren26,27,28,Vögeln 29 und Amphibien30. Obwohl die Gonadeektomie-Wirkung auf die Fortpflanzungsphysiologie alternativ von Sexualsteroidantagonisten wie Tamoxifen und Clomifen nachgeahmt werden kann, scheint die Wirkung der Medikamente aufgrund bimodaler Wirkungen inkonsistent zu sein31,32. Chronische Exposition gegenüber einem Sexualsteroidantagonisten kann zu einer Ovarialvergrößerung führen33,34, die die Beobachtung seiner Auswirkungen für langfristige Zwecke aufgrund eines ungesunden Phänotyps deaktivieren kann. Darüber hinaus ist es unmöglich, ein Erholungsexperiment nach der Behandlung mit Sexualsteroidantagonisten durchzuführen, um die spezifische Wirkung bestimmter Sexualsteroide zu gewährleisten. Zusammen mit diesen oben genannten Punkten wurden andere Kompromisse bei der Verwendung von Sexsteroid-Antagonisten ausführlich überprüft31,32. Daher erscheint die Gonadektomie auch heute noch als eine leistungsfähige Technik, um die Rolle von Sexualsteroiden zu untersuchen.
Während Gonadektomie- und Blutentnahmetechniken bei größeren Arten wie dem Europäischen Wolfsbarsch (Dicentrarchus labrax)35, Dem Blaukopflippfisch (Thalassoma bifasciatum)36, Dornhai (Scyliorhinus canicula)37 und Wels (Heteropneustes fossilis und Clarias bathracus)38,39) relativ einfach durchzuführen sind, stellen sie Herausforderungen dar, wenn sie bei kleinen Fischen als Medaka angewendet werden. Zum Beispiel ist die Verwendung von Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 weniger machbar und scheint anfällig für übermäßige körperliche Schäden für kleine Fische zu sein. Darüber hinaus ist ein Gonadektomieverfahren, das üblicherweise für größere Fische40 verwendet wird, nicht für kleine Fische geeignet, die eine hohe Präzision erfordern, um übermäßige Schäden zu vermeiden. Schließlich ist die Blutentnahme aufgrund des begrenzten Zugangs zu Blutgefäßen und der geringen Blutmenge bei diesen Tieren eine Herausforderung. Daher ist ein klares Protokoll, das jeden Schritt der Gonadeektomie und Blutentnahme in einem kleinen Teleost demonstriert, von Bedeutung.
Dieses Protokoll demonstriert die Schrittweisen Verfahren der Gonadektomie, gefolgt von Blutentnahmen in japanischen Medaka, einem kleinen Süßwasserfisch, der in Ostasien beheimatet ist. Japanische Medaka haben ein sequenziertes Genom, mehrere molekulare und genetische Werkzeuge zur Verfügung25und ein genetisches Geschlechtsbestimmungssystem, das die Untersuchung sexueller Unterschiede ermöglicht, bevor sekundäre Geschlechtsmerkmale oder Gonaden gut entwickelt sind41. Interessanterweise besitzen japanische Medaka verschmolzene Gonaden im Gegensatz zu vielen anderen Teleost-Arten42. Diese beiden Techniken zusammen dauern insgesamt nur 8 Minuten und vervollständigen die Liste der bereits für diese Spezies vorhandenen Videoprotokolle, darunter die Markierung von Blutgefäßen43,Patch-Clamp an Hypophysenabschnitten44 und Gehirnneuronen45und primäre Zellkultur46. Diese Techniken werden es der Forschungsgemeinschaft ermöglichen, die Rolle von Sexualsteroiden in Feedback-Mechanismen sowie die Plastizität von Gehirn und Hypophyse in Zukunft zu untersuchen und besser zu verstehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie in früheren Literaturliteratur berichtet, werden Gonadektomie und Blutentnahme seit langem in anderen Modellarten verwendet, um Fragen im Zusammenhang mit der Rolle von Sexualsteroiden bei der Regulierung der BPG-Achse zu untersuchen. Diese Techniken scheinen jedoch nur für größere Tiere geeignet zu sein. In Anbetracht der geringen Größe des häufig verwendeten Teleostmodells, der japanischen Medaka, bieten wir ein detailliertes Protokoll für Gonadektomie und Blutentnahme, das für diese Spezies machbar ist.</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Frau Lourdes Carreon G Tan für ihre Unterstützung bei der Fischzucht. Diese Arbeit wurde von NMBU, Grants-in-Aid der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant-Nummer 18H04881 und 18K19323) und Zuschüssen für Grundlagenforschungsprojekte von der Sumitomo Foundation an S.K.
Materials
| Glass capilary | GD1 | Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige | |
| Heparin sodium salt | H4784-1G | Sigma-aldrich | |
| Needle puller | P97 | Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument | |
| Nylon thread | N45VL | Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun | |
| Plastic tube | T9661 | Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich | |
| Razor blade | – | Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com | |
| Silicone capillary | a16090800ux0403 | Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com | |
| Tricaine | WXBC9102V | Aldrich chemistry |
References
- Weltzien, F. -. A., Andersson, E., Andersen, &. #. 2. 1. 6. ;., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Yaron, Z., Levavi-Sivan, B., Farrell, A. P. . Encyclopedia of Fish Physiology. 2, 1500-1508 (2011).
- Goldman, B. D. The circadian timing system and reproduction in mammals. Steroids. 64 (9), 679-685 (1999).
- Taranger, G. L., et al. Control of puberty in farmed fish. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 483-515 (2010).
- Messinis, I. E. Ovarian feedback, mechanism of action and possible clinical implications. Human Reproduction Update. 12 (5), 557-571 (2006).
- Diotel, N., et al. The brain of teleost fish, a source, and a target of sexual steroids. Frontiers in Neuroscience. 5, 137 (2011).
- Diotel, N., et al. Steroid Transport, Local Synthesis, and Signaling within the Brain: Roles in Neurogenesis, Neuroprotection, and Sexual Behaviors. Frontiers in Neuroscience. 12, 84 (2018).
- Larson, T. A. Sex Steroids, Adult Neurogenesis, and Inflammation in CNS Homeostasis, Degeneration, and Repair. Frontiers in Endocrinology. 9, 205 (2018).
- Fontaine, R., et al. Gonadotrope plasticity at cellular, population and structural levels: A comparison between fishes and mammals. General and Comparative Endocrinology. 287, 113344 (2020).
- Fontaine, R., Royan, M. R., von Krogh, K., Weltzien, F. -. A., Baker, D. M. Direct and indirect effects of sex steroids on gonadotrope cell plasticity in the teleost fish pituitary. Frontiers in Endocrinology. , (2020).
- Kanda, S. Evolution of the regulatory mechanisms for the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in vertebrates-hypothesis from a comparative view. General and Comparative Endocrinology. 284, 113075 (2019).
- Schreck, C. B. Stress and fish reproduction: The roles of allostasis and hormesis. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 549-556 (2010).
- Wendelaar Bonga, S. E. The stress response in fish. Physiological Reviews. 77 (3), 591-625 (1997).
- Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 129 (2), 207-219 (2001).
- Won, E., Borski, R. Endocrine Regulation of Compensatory Growth in Fish. Front. Endocrinol. 4, 74 (2013).
- MacKenzie, D. S., VanPutte, C. M., Leiner, K. A. Nutrient regulation of endocrine function in fish. Aquaculture. 161 (1), 3-25 (1998).
- Rønnestad, I., Thorsen, A., Finn, R. N. Fish larval nutrition: a review of recent advances in the roles of amino acids. Aquaculture. 177 (1), 201-216 (1999).
- Borg, B. Androgens in teleost fishes. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 109 (3), 219-245 (1994).
- Rege, J., et al. Circulating 11-oxygenated androgens across species. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 190, 242-249 (2019).
- Blázquez, M., Bosma, P. T., Fraser, E. J., Van Look, K. J. W., Trudeau, V. L. Fish as models for the neuroendocrine regulation of reproduction and growth. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 119 (3), 345-364 (1998).
- Zambrano, D. Innervation of the teleost pituitary. General and Comparative Endocrinology. 3, 22-31 (1972).
- Weltzien, F. -. A., Hildahl, J., Hodne, K., Okubo, K., Haug, T. M. Embryonic development of gonadotrope cells and gonadotropic hormones – Lessons from model fish. Molecular and Cellular Endocrinology. 385 (1), 18-27 (2014).
- Harris, M. P., Henke, K., Hawkins, M. B., Witten, P. E. Fish is Fish: the use of experimental model species to reveal causes of skeletal diversity in evolution and disease. Journal of applied ichthyology. 30 (4), 616-629 (2014).
- Powers, D. Fish as model systems. Science. 246 (4928), 352-358 (1989).
- Naruse, K., Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. . Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. , 19-37 (2011).
- Green, P. G., et al. Sex Steroid Regulation of the Inflammatory Response: Sympathoadrenal Dependence in the Female Rat. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 4082-4089 (1999).
- Pakarinen, P., Huhtaniemi, I. Gonadal and sex steroid feedback regulation of gonadotrophin mRNA levels and secretion in neonatal male and female rats. Journal of Molecular Endocrinology. 3 (2), 139 (1989).
- Purves-Tyson, T. D., et al. Testosterone regulation of sex steroid-related mRNAs and dopamine-related mRNAs in adolescent male rat substantia nigra. BMC Neuroscience. 13 (1), 95 (2012).
- Adkins-Regan, E., Ascenzi, M. Sexual differentiation of behavior in the zebra finch: Effect of early gonadectomy or androgen treatment. Hormones and Behavior. 24 (1), 114-127 (1990).
- McCreery, B. R., Licht, P. Effects of gonadectomy and sex steroids on pituitary gonadotrophin release and response to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) agonist in the bullfrog, Rana catesbeiana. General and Comparative Endocrinology. 54 (2), 283-296 (1984).
- Clark, J. H., Markaverich, B. M. The agonistic-antagonistic properties of clomiphene: a review. Pharmacology & Therapeutics. 15 (3), 467-519 (1981).
- Mourits, M. J. E., et al. Tamoxifen treatment and gynecologic side effects: a review. Obstetrics & Gynecology. 97 (5), 855-866 (2001).
- Wallach, E., Huppert, L. C. Induction of Ovulation with Clomiphene Citrate. Fertility and Sterility. 31 (1), 1-8 (1979).
- Moradi, B., Kazemi, M. A., Rahamni, M., Gity, M. Ovarian hyperstimulation syndrome followed by ovarian torsion in premenopausal patient using adjuvant tamoxifen treatment for breast cancer. Asian Pacific Journal of Reproduction. 5 (5), 442-444 (2016).
- Alvarado, M. V., et al. Actions of sex steroids on kisspeptin expression and other reproduction-related genes in the brain of the teleost fish European sea bass. The Journal of Experimental Biology. 219 (21), 3353-3365 (2016).
- Godwin, J., Crews, D., Warner, R. R. Behavioural sex change in the absence of gonads in a coral reef fish. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 263 (1377), 1683-1688 (1996).
- Jenkins, N., Dodd, J. M. Effects of ovariectomy of the dogfish Scyliorhinus canicula L. on circulating levels of androgen and oestradiol and on pituitary gonadotrophin content. Journal of Fish Biology. 21 (3), 297-303 (1982).
- Manickam, P., Joy, K. P. Changes in hypothalamic catecholamine levels in relation to season, ovariectomy and 17β-estradiol replacement in the catfish, Clarias batrachus (L.). General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 167-174 (1990).
- Senthilkumaran, B., Joy, K. P. Effects of ovariectomy and oestradiol replacement on hypothalamic serotonergic and monoamine oxidase activity in the catfish, Heteropneustes fossilis: a study correlating plasma oestradiol and gonadotrophin levels. Journal of Endocrinology. 142 (2), 193-203 (1994).
- Sladky, K. K., Clarke, E. O. Fish Surgery: Presurgical Preparation and Common Surgical Procedures. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 19 (1), 55-76 (2016).
- Hori, H., Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. . Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. , 1-16 (2011).
- Murata, K., Kinoshita, M., Naruse, K., Tanaka, M., Kamei, Y., Murata, K., et al. . Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. 2, 49-95 (2019).
- Fontaine, R., Weltzien, F. -. A. Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. -. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. Journal of Visualized Experiments. (74), e50312 (2013).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka – model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2002).
- Kayo, D., Oka, Y., Kanda, S. Examination of methods for manipulating serum 17β-Estradiol (E2) levels by analysis of blood E2 concentration in medaka (Oryzias latipes). General and Comparative Endocrinology. 285, 113272 (2020).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. British Journal of Haematology. 107 (4), 731-738 (1999).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (102), e53272 (2015).
- Taves, M. D., et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PloS one. 5 (12), 15727 (2010).
- Holtkamp, H. C., Verhoef, N. J., Leijnse, B. The difference between the glucose concentrations in plasma and whole blood. Clinica Chimica Acta. 59 (1), 41-49 (1975).
- Kanda, S., et al. Identification of KiSS-1 Product Kisspeptin and Steroid-Sensitive Sexually Dimorphic Kisspeptin Neurons in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 149 (5), 2467-2476 (2008).
- Kanda, S., Karigo, T., Oka, Y. Steroid Sensitive kiss2 Neurones in the Goldfish: Evolutionary Insights into the Duplicate Kisspeptin Gene-Expressing Neurones. Journal of Neuroendocrinology. 24 (6), 897-906 (2012).
- Mitani, Y., Kanda, S., Akazome, Y., Zempo, B., Oka, Y. Hypothalamic Kiss1 but Not Kiss2 Neurons Are Involved in Estrogen Feedback in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 151 (4), 1751-1759 (2010).
- Kayo, D., Zempo, B., Tomihara, S., Oka, Y., Kanda, S. Gene knockout analysis reveals essentiality of estrogen receptor β1 (Esr2a) for female reproduction in medaka. Scientific Reports. 9 (1), 8868 (2019).
- Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -. A. Plasticity in medaka gonadotropes via cell proliferation and phenotypic conversion. Journal of Endocrinology. 245 (1), 21 (2020).
- Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -. A. Plasticity of Lh cells caused by cell proliferation and recruitment of existing cells. Journal of Endocrinology. 240 (2), 361 (2019).
- Hasebe, M., Kanda, S., Oka, Y. Female-Specific Glucose Sensitivity of GnRH1 Neurons Leads to Sexually Dimorphic Inhibition of Reproduction in Medaka. Endocrinology. 157 (11), 4318-4329 (2016).
