Génération et assemblage de nucléoopsides spécifiques au virus du virus respiratoire syncytial
Summary
Pour l’analyse mécaniste approfondie de la synthèse respiratoire syncytiale d’ARN du virus (RSV), nous rapportons un protocole d’utilisation de la phosphoprotéine chaperon (P) pour la coexpression de la nucléoprotéine ARN-libre (N0)pour l’assemblage in vitro suivant des nucléocapsides virus-spécifiques (NCs).
Abstract
L’utilisation d’un modèle d’ARN authentique est essentielle pour faire progresser les connaissances fondamentales sur la synthèse de l’ARN viral qui peuvent guider à la fois la découverte mécaniste et le développement d’essais en virologie. Le modèle d’ARN des virus à ARN non segmentés à sens négatif (NNS), tels que le virus respiratoire syncytial (RSV), n’est pas une molécule d’ARN seule, mais plutôt un complexe de ribonucléoprotéines encapsulées de nucléoprotéines (N). Malgré l’importance du modèle d’ARN authentique, la génération et l’assemblage d’un tel complexe ribonucléoprotéique restent sophistiqués et nécessitent une élucidation en profondeur. Le principal défi est que le RSV N surexprimé se lie non spécifiquement aux ARN cellulaires pour former des particules aléatoires de type nucléocoside (NCLPs). Ici, nous avons établi un protocole pour obtenir N sans ARN(N0)d’abord en co-exprimant N avec une phosphoprotéine chaperon (P), puis en assemblantN0 avec des oligos d’ARN avec la séquence d’ARN spécifique au RSV pour obtenir des nucléopsides spécifiques au virus (NCs). Ce protocole montre comment surmonter la difficulté dans la préparation de ce complexe viral traditionnellement provocant de ribonucleoprotein.
Introduction
Les virus à ARN à sens négatif (NNS) non segmentés comprennent de nombreux agents pathogènes humains importants, tels que la rage, Ebola et le virus respiratoire syncytial (RSV)1,2. Le RSV est la principale cause de maladies respiratoires telles que la bronchiolite et la pneumonie chez les jeunes enfants et les adultes plus âgés dans le monde3. À l’heure actuelle, il n’existe aucun vaccin ou traitement antiviral efficace pour prévenir ou traiter le RSV4. Dans le cadre du cycle de vie, le génome du RSV sert de modèle pour la réplication par l’ARN polymérase dépendante de l’ARN du RSV pour produire un antigénique, qui à son tour agit comme modèle pour générer un génome de progéniture. Les ARN du génome et de l’antigène sont entièrement encapsulés par la nucléoprotéine (N) pour former les nucléocapsides (NCs)3. Étant donné que les NCs servent de modèles pour la réplication et la transcription par la polymérase RSV, un assemblage NC approprié est crucial pour que la polymérase accède aux modèles pour la synthèse de l’ARN5. Fait intéressant, sur la base des analyses structurelles des polymérases virales NNS, on émet l’hypothèse que plusieurs protéines N se dissocient transitoirement des NCs pour permettre l’accès de la polymérase et se rebinent à l’ARN après la synthèse de l’ARN6,7,8,9,10,11,12.
Actuellement, le test de polymérisation de l’ARN RSV a été établi en utilisant de la polymérase RSV purifiée sur de courts modèles d’ARN nu13,14. Cependant, les activités de la polymérase RSV n’atteignent pas optimales, comme observé dans les produits non processifs et abortifs générés par la polymérase RSV lors de l’utilisation de modèles d’ARN nu. L’absence de NC avec l’ARN spécifique au virus est un obstacle principal à la compréhension mécaniste de la synthèse de l’ARN du RSV. Par conséquent, l’utilisation d’un modèle d’ARN authentique devient un besoin critique pour faire progresser les connaissances fondamentales de la synthèse de l’ARN du RSV. Les structures connues des particules de type nucléoscopique (NCLPs) provenant du RSV et d’autres virus à ARN NNS révèlent que les ARN dans les NCLPs sont soit des ARN cellulaires aléatoires, soit des ARN génomiques viraux moyens15,16,17,18,19. Ensemble, le principal obstacle est que N se lie non spécifiquement aux ARN cellulaires pour former des NCLPs lorsque N est surexprimé dans les cellules hôtes.
Pour surmonter cet obstacle, nous avons établi un protocole pour obtenir d’abord sans ARN(N0)et assemblerN0 avec de l’ARN génomique viral authentique en NCLPs20. Le principe de ce protocole est d’obtenir une grande quantité de N(N0)sans ARN recombinant en co-exprimant N avec un chaperon, le domaine N-terminal de la phosphoprotéine RSV (PNTD). Le N0P purifié pourrait être stimulé et assemblé en NCLPs en ajoutant des oligos d’ARN spécifiques au RSV, et pendant le processus d’assemblage, le chaperon PNTD est déplacé lors de l’ajout d’oligos d’ARN.
Ici, nous détaillons un protocole pour la génération et l’assemblage de CN spécifiques à l’ARN RSV. Dans ce protocole, nous décrivons le clonage moléculaire, la préparation de protéine, l’assemblage in vitro, et la validation de l’assemblage complexe. Nous mettons en évidence la stratégie de clonage pour générer des constructions bi-cistroniques pour la coexpression de protéines pour le clonage moléculaire. Pour la préparation des protéines, nous décrivons les procédures de culture cellulaire, d’extraction des protéines et de purification du complexe protéique. Ensuite, nous discutons de la méthode d’assemblage in vitro des CN spécifiques à l’ARN RSV. Enfin, nous utilisons la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et la microscopie électronique à taches négatives (EM) pour caractériser et visualiser les NCLPs assemblés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les structures connues de particules de type nucléocopside (NCLP) des virus à ARN non segmentés à sens négatif (NNS) montrent que les NCLPs assemblés sont le complexe N avec des ARN cellulaires hôtes lorsqu’ils sont surexprimés dans les systèmes d’expression bactérienne ou eucaryote15,16,17,18,19. Des études antérieures ont tenté d’obtenir l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les programmes de recherche du laboratoire Liang à Emory sont soutenus par le National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) des États-Unis, les National Institutes of Health (NIH) sous le numéro de bourse R01GM130950 et le Research Start-Up Fund de l’École de médecine de l’Université Emory. L’auteur remercie les membres du laboratoire Liang pour leur soutien utile et leur discussion critique.
Materials
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
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