Posizione, dissezione e analisi del Ganglio Stellato Murine
Summary
I cambiamenti fisiopatologici nel sistema nervoso autonomo cardiaco, specialmente nel suo ramo simpatico, contribuiscono all’insorgenza e al mantenimento delle aritmie ventricolari. Nel presente protocollo, mostriamo come caratterizzare i gangli stellati murini per migliorare la comprensione dei processi molecolari e cellulari sottostanti.
Abstract
Il sistema nervoso autonomo è un importante driver dell’elettrofisiologia cardiaca. Soprattutto il ruolo del suo ramo simpatico è una questione di indagine in corso nella fisiopatologia delle aritmie ventricolari (VA). I neuroni nei gangli stellati (SG) – strutture bilaterali a forma di stella della catena simpatica – sono una componente importante dell’infrastruttura simpatica. L’SG è un obiettivo riconosciuto per il trattamento tramite denervazione cardiaca simpatica in pazienti con VA refrattaria-terapia. Mentre il rimodellamento neuronale e l’attivazione gliale nell’SG sono stati descritti nei pazienti con VA, i processi cellulari e molecolari sottostanti che potenzialmente precedono l’insorgenza dell’aritmia non sono solo sufficientemente compresi e devono essere chiariti per migliorare la modulazione autonomica. I modelli di topo ci permettono di studiare il rimodellamento neuronale simpatico, ma l’identificazione dell’SG murino è una sfida per l’investigatore inesperto. Pertanto, mancano studi biologici cellulari e molecolari approfonditi dell’SG murino per molte malattie cardiache comuni. Qui descriviamo un repertorio di base per la dissezione e lo studio dell’SG nei topi adulti per analisi a livello di RNA (isolamento dell’RNA per analisi dell’espressione genica, ibridazione in situ), livello proteico (colorazione immunofluorescente dell’intero supporto) e livello cellulare (morfologia di base, misurazione delle dimensioni delle cellule). Presentiamo potenziali soluzioni per superare le sfide nella tecnica di preparazione e come migliorare la colorazione attraverso la tempra dell’autofluorescenza. Ciò consente la visualizzazione di neuroni e cellule gliali tramite marcatori stabiliti al fine di determinare la composizione cellulare e i processi di rimodellamento. I metodi qui presentati consentono di caratterizzare l’SG per ottenere ulteriori informazioni sulla disfunzione autonoma nei topi inclini all’AV e possono essere integrati da tecniche aggiuntive che studiano i componenti neuronali e gliali del sistema nervoso autonomo nel cuore.
Introduction
Il sistema nervoso autonomo cardiaco è un equilibrio strettamente regolato di componenti simpatici, parasimpatici e sensoriali che consente al cuore di adattarsi ai cambiamenti ambientali con l’appropriata rispostafisiologica 1,2. Disturbi in questo equilibrio, ad esempio, un aumento dell’attività simpatica, sono stati stabiliti come driver chiave per l’insorgenza e il mantenimento delle aritmie ventricolari (VA)3,4. Pertanto, la modulazione autonoma, ottenuta attraverso la riduzione farmacologica dell’attività simpatica con beta-bloccanti, è stata una pietra miliare nel trattamento dei pazienti con VAper decenni 5,6. Ma nonostante gli interventi farmacologici e cateteri, un numero rilevante di pazienti soffre ancora di VA7 ricorrente.
L’input simpatico al cuore è per lo più mediato attraverso corpi cellulari neuronali nei gangli stellati (SG), strutture bilaterali a forma di stella della catena simpatica, che relè le informazioni attraverso numerosi nervi intratoracici dal tronco encefalicoal cuore 8,9,10. Il nervo che germoglia dall’SG dopo la lesione è associato all’AV e alla morte cardiacaimprovvisa 11,12,sottolineando l’SG come bersaglio per la modulazione autonomica13,14. Una riduzione dell’input simpatico al cuore può essere ottenuta temporaneamente tramite iniezione percutanea di anestetici locali o permanentemente mediante rimozione parziale dell’SG tramite toracoscopia video-assistita15,16. La denervazione cardiaca simpatica presenta un’opzione per i pazienti con VA refrattaria terapeuticacon risultati promettenti 14,16,17. Abbiamo imparato dall’SG estipeato di questi pazienti che il rimodellamento neuronale e neurochimico, la neuro-infiammazione e l’attivazione gliale sono segni distintivi del rimodellamento simpatico che potrebbe contribuire o aggravare la disfunzioneautonomica 18,19. Tuttavia, i processi cellulari e molecolari sottostanti in questi neuroni rimangono oscuri fino ad oggi, ad esempio il ruolo della transdifferenziazione neuronale in un fenotipo colinergico20,21. Studi sperimentali presentano nuovi approcci per trattare l’AV, ad esempio la riduzione dell’attività nervosa simpatica attraverso l’optogenetica22, ma la caratterizzazione approfondita dell’SG è ancora carente in molte patologie cardiache che vanno di pari passo con l’AV. I modelli di topo che imitano queste patologie consentono di studiare il rimodellamento neuronale che potenzialmente precede l’insorgenza delle aritmie12,23. Questi possono essere completati da ulteriori analisi morfologiche e funzionali per la caratterizzazione autonomica del cuore e del sistema nervoso. Nel presente protocollo, forniamo un repertorio di base di metodi che consentono di sezionare e caratterizzare l’SG murino per migliorare la comprensione dell’AV.
Protocol
Representative Results
Discussion
La comprensione dei processi cellulari e molecolari nei neuroni e nelle cellule gliali del sistema nervoso simpatico che precedono l’insorgenza dell’AV è di alto interesse, poiché l’arresto cardiaco improvviso rimane la causa più comune di morte intutto il mondo 5. Pertanto, nel manoscritto attuale, forniamo un repertorio di base di metodi per identificare l’SG murino – un elemento murino all’interno di questa rete – ed eseguire analisi successive a livello di RNA, proteine e cellulare.
<p …Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Hartwig Wieboldt per la sua eccellente assistenza tecnica e l’UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) dell’University Medical Center Hamburg-Eppendorf per aver fornito microscopi e supporto. Questa ricerca è stata finanziata dal DZHK (Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| 96-well plate | TPP | 92097 | RNAscope |
| Adhesion Slides SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopy |
| Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. | Serva | 11924.03 | Whole mount staining |
| bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Donkey anti chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Donkey anti goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Drying block 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Whole mount staining |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Whole mount staining |
| Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Whole mount staining |
| Eukitt mounting medium | AppliChem | 253681.0008 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Preparation SG |
| High-capacity cDNA reverse transctiption kit | Life technologies | 4368813 | RNA isolation |
| Isoflurane (Forene) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparation SG |
| Mayer's hemalum solution | Merck | 1.09249.0500 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Microscope cover glasses 20×20 mm or smaller | Marienfeld | 0101040 | Whole mount staining |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA isolation |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | RNA isolation |
| Opal 570 Reagent Pack | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 43368 | Whole mount staining |
| Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco | 18912-014 | Whole mount staining |
| Pinzette Dumont SS Forceps | FineScienceTools | 11203-25 | Preparation SG |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | RNA isolation |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| RNAlater | Merck | R0901-100ML | RNA isolation (optional) |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
| Stainless steel beads 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA isolation |
| Sudan black B | Roth | 0292.2 | Whole mount staining |
| TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan mastermix | Applied biosystems | 4370074 | Gene Expression analysis |
| Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA isolation |
| Triton X-100 10% solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole mount staining |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
| Wacom bamboo pen | Wacom | CTL-460/K | Cell size measurements |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole mount staining |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
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