Патофизиологические изменения в вегетативной нервной системе сердца, особенно в ее симпатической ветви, способствуют возникновению и поддержанию желудочковых аритмий. В настоящем протоколе мы показываем, как охарактеризовать мышиные звездчатые ганглии, чтобы улучшить понимание лежащих в основе молекулярных и клеточных процессов.
Вегетативная нервная система является существенным драйвером электрофизиологии сердца. Особенно роль его симпатической ветви является постоянным предметом исследований в патофизиологии желудочковых аритмий (ВА). Нейроны в звездчатых ганглиях (SG) — двусторонних звездообразных структурах симпатической цепи — являются важным компонентом симпатической инфраструктуры. SG являются признанной мишенью для лечения с помощью сердечной симпатической денервации у пациентов с терапевтически-рефрактерным ВА. В то время как ремоделирование нейронов и глиальная активация в SG были описаны у пациентов с ВА, основные клеточные и молекулярные процессы, которые потенциально предшествуют началу аритмии, только недостаточно изучены и должны быть выяснены для улучшения вегетативной модуляции. Мышиные модели позволяют изучать симпатическое ремоделирование нейронов, но идентификация мышиного SG является сложной задачей для неопытного исследователя. Таким образом, углубленные клеточные и молекулярно-биологические исследования мышиного SG отсутствуют для многих распространенных сердечных заболеваний. Здесь мы описываем базовый репертуар для рассечения и изучения SG у взрослых мышей для анализа на уровне РНК (выделение РНК для анализа экспрессии генов, гибридизация in situ), уровне белка (иммунофлуоресцентное окрашивание цельного крепления) и клеточном уровне (базовая морфология, измерение размера клеток). Мы представляем потенциальные решения для преодоления проблем в технике приготовления и способы улучшения окрашивания путем гашения автофлуоресценции. Это позволяет визуализировать нейроны, а также глиальные клетки с помощью установленных маркеров для определения состава клеток и процессов ремоделирования. Представленные здесь методы позволяют охарактеризовать СГ для получения дополнительной информации о вегетативной дисфункции у мышей, склонных к ВА, и могут быть дополнены дополнительными методиками, исследующими нейронные и глиальные компоненты вегетативной нервной системы в сердце.
Сердечная вегетативная нервная система представляет собой жестко регулируемое равновесие симпатических, парасимпатических и сенсорных компонентов, которое позволяет сердцу адаптироваться к изменениям окружающей среды с соответствующей физиологической реакцией1,2. Нарушения в этом равновесии, например, повышение симпатической активности, были установлены в качестве ключевого фактора возникновения, а также поддержания желудочковых аритмий (ВА)3,4. Поэтому вегетативная модуляция, достигаемая за счет фармакологического снижения симпатической активности бета-адреноблокаторами, была краеугольным камнем в лечении пациентов с ВА на протяжении десятилетий5,6. Но, несмотря на фармакологические и катетерные вмешательства, соответствующее число пациентов все еще страдает от рецидивирующего VA7.
Симпатический вход в сердце в основном опосредован через тела нейронных клеток в звездчатых ганглиях (SG), двусторонних звездообразных структурах симпатической цепи, которые передают информацию через многочисленные внутриторакальные нервы от ствола мозга к сердцу8,9,10. Прорастание нерва из СГ после травмы связано с ВА и внезапной сердечной смертью11,12,подчеркивая СГ как мишень для вегетативной модуляции13,14. Снижение симпатического поступления в сердце может быть достигнуто временно путем чрескожной инъекции местных анестетиков или постоянно путем частичного удаления SG с помощью видеоассистированной торакоскопии15,16. Сердечная симпатическая денервация представляет собой вариант для пациентов с терапией-рефрактерной ВА с многообещающими результатами14,16,17. Мы узнали из эксплантированного SG этих пациентов, что нейронное и нейрохимическое ремоделирование, нейровоспаление и глиальная активация являются отличительными признаками симпатического ремоделирования, которые могут способствовать или усугублять вегетативную дисфункцию18,19. Тем не менее, лежащие в основе клеточные и молекулярные процессы в этих нейронах остаются неясными на сегодняшний день, например, роль трансдифференциации нейронов в холинергический фенотип20,21. Экспериментальные исследования представляют новые подходы к лечению ВА, например, снижение активности симпатического нерва с помощью оптогенетики22,но углубленная характеристика SG все еще отсутствует во многих сердечных патологиях, которые идут рука об руку с VA. Мышиные модели, имитирующие эти патологии, позволяют изучать ремоделирование нейронов, которое потенциально предшествует возникновению аритмий12,23. Они могут быть дополнены дальнейшими морфологическими и функциональными анализами для вегетативной характеристики сердца и нервной системы. В настоящем протоколе мы предоставляем базовый репертуар методов, позволяющих препарировать и характеризовать мышиную СГ для улучшения понимания ВА.
Понимание клеточных и молекулярных процессов в нейронах и глиальных клетках симпатической нервной системы, которые предшествуют началу ВА, представляет большой интерес, так как внезапная остановка сердца остается наиболее распространенной причиной смерти во всем мире5. …
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Хартвига Вибольдта за его отличную техническую помощь и Центр микроскопической визуализации UKE (Umif) Университетского медицинского центра Гамбург-Эппендорф за предоставление микроскопов и поддержку. Это исследование финансировалось DZHK (Немецкий центр сердечно-сосудистых исследований) [FKZ 81Z4710141].
96-well plate | TPP | 92097 | RNAscope |
Adhesion Slides SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopy |
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. | Serva | 11924.03 | Whole mount staining |
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Whole mount staining |
Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
Donkey anti chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
Donkey anti goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
Drying block 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Whole mount staining |
Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Whole mount staining |
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Whole mount staining |
Eukitt mounting medium | AppliChem | 253681.0008 | Whole mount staining |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Whole mount staining |
Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole mount staining |
Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Preparation SG |
High-capacity cDNA reverse transctiption kit | Life technologies | 4368813 | RNA isolation |
Isoflurane (Forene) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparation SG |
Mayer's hemalum solution | Merck | 1.09249.0500 | Whole mount staining |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
Microscope cover glasses 20×20 mm or smaller | Marienfeld | 0101040 | Whole mount staining |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA isolation |
NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | RNA isolation |
Opal 570 Reagent Pack | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 43368 | Whole mount staining |
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Whole mount staining |
Phosphate-buffered saline tablets | Gibco | 18912-014 | Whole mount staining |
Pinzette Dumont SS Forceps | FineScienceTools | 11203-25 | Preparation SG |
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | RNA isolation |
Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
RNAlater | Merck | R0901-100ML | RNA isolation (optional) |
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
RNAscope Probe-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
Stainless steel beads 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA isolation |
Sudan black B | Roth | 0292.2 | Whole mount staining |
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
TaqMan mastermix | Applied biosystems | 4370074 | Gene Expression analysis |
Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA isolation |
Triton X-100 10% solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole mount staining |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
Wacom bamboo pen | Wacom | CTL-460/K | Cell size measurements |
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole mount staining |
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |