使用上格拉夫方法估计植物生物质的晶体纤维素含量
Summary
上格拉夫法是纤维素估计使用最广泛的方法。本次演示的主要目的是提供详细的上格拉夫协议，用于估算植物生物质样本中的纤维素含量。
Abstract
纤维素是地球上光合作用产生的最丰富的聚合物，也是细胞壁的主要承重成分。细胞壁通过提供细胞生长的强度、刚度、速率和方向、细胞形状维护以及生物和非生物应激源的保护，在植物生长发育中发挥着重要作用。细胞壁主要由纤维素、木质素、血糖和果胶组成。最近，植物细胞壁成为第二代生物燃料和生物能源生产的目标。具体来说，植物细胞壁的纤维素成分用于纤维素乙醇的生产。生物量纤维素含量的估计对于基础和应用细胞壁研究至关重要。Updegraff方法简单、坚固，是估计植物生物量结晶纤维素含量的最广泛应用的方法。酒精不溶性粗细胞壁分数在治疗与厄普德格拉夫试剂消除血细胞素和木质素分数。后来，上格拉夫耐纤维素分量受到硫酸处理，将纤维素同聚合体水解成单体葡萄糖单位。使用各种葡萄糖浓度开发回归线，用于估计实验样本中纤维素水解后释放的葡萄糖量。最后，纤维素含量根据按彩色测定炭甲基检测的葡萄糖单体量进行估计。
Introduction
纤维素是细胞壁的主要承重成分，存在于主细胞壁和辅助细胞壁中。细胞壁是环绕植物细胞的细胞外基质，主要由纤维素、木质素、血糖、果胶和基质蛋白组成。大约三分之一的植物生物量是纤维素1，它通过提供强度、刚性、细胞生长的速度和方向、细胞形状维护以及防止生物和非生物应激因素，在植物生长发育中发挥着重要作用。棉纤维含有95%纤维素2含量，而树木含有40%至50%的纤维素，这取决于植物种类和器官类型3。纤维素由纤维素的重复单位组成，纤维素是葡萄糖残留物的去除，由β-1，4糖体键4连接。纤维素乙醇是由葡萄糖从植物细胞壁5中存在的纤维素中提取的。纤维素纤维由几个微纤维组成，其中每个微纤维作为核心单位与500-15000葡萄糖单体1，6。纤维素同聚物由等离子膜嵌入纤维素合成酶复合物（CSC的）1，7合成。单个纤维素合成酶A（CESA）蛋白合成葡萄糖链和相邻的葡萄糖链通过氢键连接，形成晶体纤维素1，8。纤维素存在于几个晶体形式与两种主要形式，纤维素I+和纤维素I+作为原生形式9。在较高的植物中，纤维素存在于纤维素I+形式中，而低植物纤维素存在于I+形式10，11中。总的来说，纤维素在向植物细胞壁传授力量和刚性方面起着重要作用。
第一代生物燃料主要产自玉米淀粉、甘蔗糖和甜菜糖，它们是食物来源，而第二代生物燃料则主要生产来自非食品植物生物质细胞壁材料12的生物燃料。准确估计结晶纤维素含量不仅对纤维素生物合成和细胞壁动力学的基础研究具有重要意义，而且对应用生物燃料和生物制品研究也具有重要意义。开发和优化了多种植物生物量纤维素估算方法，上格拉夫法是纤维素估算中应用最广泛的方法。第一个报告的纤维素估计方法是由克罗斯和贝文在1908年13。该方法基于硫酸钠交替氯化和提取的原则。然而，由克罗斯和贝文方法的原始和修改协议获得的纤维素显示，除了大量的木质素和曼南14的微小部分污染。尽管对从纤维素部分去除木质素和半纤维素进行了多次修改，但交叉贝文方法保留了相当数量的曼南和纤维素。后来，库尔施纳的方法是利用硝酸和乙醇提取纤维素15。该方法指出，总木质素和75%的五氯苯甲酸被去除，但真正的纤维素结果与十字和贝文的氯化方法估计的结果相同。另一种方法（诺曼和詹金斯）是利用甲醇苯、硫酸钠和次氯酸钠提取纤维素16而开发的。这种方法还保留了一些部分木质素 （3%）和大量的五氯苯二酯导致在纤维素的准确估计。后来，基塞尔和塞米加诺夫斯基使用另一种方法，使用80%浓缩硫酸对纤维素进行水解，而水解减少的糖分则由贝特朗的方法17估计。根据基塞尔和塞米加诺夫斯基的方法开发的两种方法，瓦克斯曼和史蒂文斯18和萨洛14，19，也比早期的方法20少4-5%纤维素含量。
上格拉夫法是估计结晶纤维素含量最广泛的方法。1969年21年，乌普德格拉夫首次对纤维素的测量方法进行描述。Updegraff方法将库尔施纳法（使用硝酸）、基塞尔和塞米诺斯基方法（用硫酸将纤维素水解成葡萄糖单体）与一些修改相结合，并结合了维尔斯和西尔弗曼的炭热检测，用于对葡萄糖和结晶纤维素含量进行简单的色度估计。这种方法的原理是使用醋酸和硝酸（上格拉夫试剂）从同质化植物组织中去除半球素和木质素，从而留下耐醋酸/耐硝酸纤维素作进一步加工和估计。醋酸/耐硝酸纤维素用67%的硫酸处理，将纤维素分解成葡萄糖单体，释放的葡萄糖单体估计由炭酸检测21，23。对原来的上格拉夫方法进行了几次修改，以简化程序和纤维素估计由炭细检测24。从广义上讲，这种方法可以分为五个阶段。在第一阶段，工厂材料已准备就绪。在第二阶段，粗细胞壁与总生物量分离，因为纤维素是植物细胞壁的关键成分。后来，在第三阶段，纤维素通过使用上格拉夫试剂处理，从非纤维素细胞壁组件中分离出来。在第四阶段，通过硫酸处理，醋酸/耐硝酸纤维素被分解成葡萄糖单体。纤维素硫酸处理导致葡萄糖单体与硫酸反应形成5-羟基硫化物化合物。最后，在最后阶段，炭热产生一个绿色的蓝色复合物，沸腾与前一阶段25产生的毛皮化合物。这种基于炭铁的色度测量方法于1942年首次被德雷伍德使用。Anthrone 是一种在酸性条件下识别五氯蔗糖和六甲酸脱水产品（如 5-羟基紫外线）的毛皮化合物的染料。与五角大厦25相比，六角形的反应产生强烈的色彩和更好的反应。受约束葡萄糖的含量以光谱光度计吸收量测量，在620纳米，绿色蓝色复合物的强度与样品中的糖量成正比。测量的吸收值与葡萄糖标准曲线回归线进行比较，以计算样品的葡萄糖浓度。测量的葡萄糖含量用于估计植物生物量的纤维素含量。
Protocol
Representative Results
Discussion
棉纤维是用棉籽生产的天然纤维。棉纤维是一种单细胞，纤维素含量约95%，纤维素含量高，在纺织行业具有广泛的应用。由于棉纤维含有约95%的纤维素，我们使用棉根组织来演示水晶纤维素含量的估计。棉根组织中等丰富的结晶纤维素含量，是一种常见的植物生物量。晶体纤维素含量所需的总细胞壁量仅为5毫克，因此可用于估计不同发育阶段/组织特定纤维素?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢植物与土壤科学与棉花公司对这项研究的部分支持。
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | A18-500 | Used in the protocol |
| Anthrone | Sigma Aldrich | 90-44-8 | For colorimetric assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifugation |
| Chloroform | Mallinckrodt | 67-66-3 | Used in the protocol |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | Used in the protocol |
| Ethanol | Millipore Sigma | EM-EX0276-4S | Used in the protocol |
| Filter paper | Whatman | 1004-090 | Positive control |
| Glacial acetic acid | Sigma | SKU A6283 | Used in the protocol |
| Heat block/ ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 13527550 | For controlled temperatures |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | Used for drying plant sample |
| Measuring Scale | Mettler Toledo | 30243386 | For specific quantities |
| Methanol 100 % | Fisher Chemical | A412-500 | Used in the protocol |
| Microplate (96 well) | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | For anthrone assay |
| Nitric acid | Sigma Aldrich | 695041 | Used in the protocol |
| Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes | BioSpec Products | 10831 | For high temperatures |
| Spectrophotometer(Multimode Detector) | Beckmancoulter DTX880 | 1000814 | For measuring absorbances |
| Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For grinding plant tissues into fine powder |
| Sulphuric acid | J.T.Baker | 02-004-382 | Used in the protocol |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | Used in the PSB buffer |
| Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Used in the protocol |
| Tris Hydrochloride | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | Used in the PSB buffer |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer (vacufuge plus) | Eppendorf | 22820001 | For drying samples |
| Vortex mixer | Fisherbrand | 14-955-151 | For mixing |
| Waterbath | Thermoscientific | TSGP02PM05 | For temperature controlled conditions at specific steps |
| Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12A | Used in the protocol |
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