Estimering af krystallinsk celluloseindhold i plantebiomasse ved hjælp af Updegraff-metoden
Summary
Updegraff-metoden er den mest anvendte metode til celluloseestimatet. Hovedformålet med denne demonstration er at tilvejebringe en detaljeret Updegraff-protokol til vurdering af celluloseindholdet i plantebiomasseprøver.
Abstract
Cellulose er den mest rigelige polymer på Jorden genereret af fotosyntese og den vigtigste bærende komponent af cellevægge. Cellevæggen spiller en væsentlig rolle i plantevækst og -udvikling ved at give styrke, stivhed, hastighed og retning af cellevækst, celleformvedligeholdelse og beskyttelse mod biotiske og abiotiske stressorer. Cellevæggen består primært af cellulose, lignin, hemicellulose og pektin. For nylig er plantecellevægge blevet målrettet mod andengenerationsbiobrændstof- og bioenergiproduktion. Specifikt anvendes cellulosekomponenten i plantecellevæggen til fremstilling af cellulosebaseret ethanol. Estimering af celluloseindholdet i biomasse er afgørende for grundlæggende forskning i cellevægge. Updegraff-metoden er enkel, robust og den mest anvendte metode til vurdering af krystallinsk celluloseindhold i plantebiomasse. Alkohol uopløselige rå cellevæg fraktion ved behandling med Updegraff reagens eliminerer hemicellulose og lignin fraktioner. Senere udsættes Updegraff-reagensresistent cellulosefraktionen for svovlsyrebehandling for at hydrolysere cellulosehompolymeren i monomere glukoseenheder. En regressionslinje udvikles ved hjælp af forskellige koncentrationer af glukose og bruges til at estimere mængden af glukose, der frigives ved cellulosehydrolyse i forsøgsprøverne. Endelig anslås celluloseindholdet baseret på mængden af glukosemonomer ved kolorometrisk anthronanalyse.
Introduction
Cellulose er den primære bærende komponent i cellevægge, som er til stede i både primære og sekundære cellevægge. Cellevæggen er en ekstracellulær matrix, der omgiver planteceller og primært består af cellulose, lignin, hemicellulose, pektin og matrixproteiner. Omkring en tredjedel af planterne biomasse er cellulose1, og det spiller en væsentlig rolle i plantevækst og udvikling ved at give styrke, stivhed, hastighed og retning af cellevækst, celleform vedligeholdelse, og beskyttelse mod biotiske og abiotiske stressfaktorer. Bomuldsfiber indeholder 95% cellulose2 indhold, mens træer indeholder 40% til 50% af cellulose afhængigt af plantearter og organtyper3. Cellulosen består af gentagne enheder af cellobiose, en disaccharid af glukoserester forbundet med β-1,4 glykosidbindinger4. Cellulose ethanol fremstilles af glucose fra den cellulose, der er til stede i plantecellevæggene5. Cellulosisk fiber består af flere mikrofibriller, hvor hver mikrofibril fungerer som kerneenhed med 500-15000 glukosemonomerer1,6. Cellulose homopolymeren syntetiseres af plasmamembran indlejrede cellulosesyntasekomplekser (CSC’er)1,7. Individuelle cellulosesyntese A -proteiner (CESA) syntetiserer glucankæder, og de tilstødende glucankæder forbindes af hydrogenbindinger til krystallinsk cellulose1,8. Cellulose findes i flere krystallinske former med to fremherskende former, cellulose Iα og cellulose Iβ som oprindelige former9. I højere planter findes cellulose i cellulose Iβ-form, mens der findes lavere plantecellulose i Iα form10,11. Samlet set cellulose spiller en væsentlig rolle i at give styrke og stivhed til planten cellevægge.
Førstegenerationsbiobrændstoffer fremstilles primært af majsstivelse, rørsukker og roesukker, som er fødevarekilder, mens andengenerationsbiobrændstoffer fokuserer på biobrændstofproduktionen fra nonfood-plantebiomassecellemateriale12. Et nøjagtigt skøn over indholdet af krystallinsk cellulose er ikke kun vigtigt for grundforskningen i cellulosebiosyntese og cellevægdynamik, men også for anvendt forskning i biobrændstof og bioprodukter. Der er udviklet og optimeret forskellige metoder til vurdering af cellulose i plantebiomassen, og Updegraff-metoden er den mest anvendte metode til celluloseestimering. Den første rapporterede metode til celluloseestimering var af Cross og Bevan i 190813. Metoden var baseret på princippet om alternativ chlorering og ekstraktion ved natriumsulfat. Den cellulose, der blev opnået ved den oprindelige såvel som ændrede protokoller for Cross- og Bevan-metoden, viste imidlertid forurening af små fraktioner af lignin ud over en betydelig mængde xylaner og mannans14. På trods af flere modifikationer for at fjerne lignin og hemicellulose fra cellulosefraktionen beholdt Cross-Bevan-metoden en betydelig mængde mannaner sammen med cellulose. Senere blev Kurschners metode udviklet ved at anvende salpetersyre og ethanol til at udvinde cellulose15. Denne metode erklærede, at den samlede lignin og 75% af pentosanerne blev fjernet, men de sande celluloseresultater var de samme som dem, der blev anslået ved kloreringsmetoden Cross og Bevan. En anden metode (Norman og Jenkins) blev udviklet ved at anvende methanolbenzen, natriumsulfat og natriumhypochlorit til at udvinde cellulose16. Denne metode beholdt også en del af lignin (3%) og betydelige mængder af pentosaner, der fører til en nøjagtig vurdering af cellulose. Senere brugte Kiesel og Semiganowsky en anden tilgang til hydrolyze cellulose ved hjælp af 80% koncentreret svovlsyre, og det hydrolyserede reducerede sukker blev anslået ved Bertrands metode17. De to metoder, Waksman’s og Stevens18 og Salo14,19, som blev udviklet baseret på Kiesel og Semiganowsky’s metode, også gav 4-5% mindre cellulose indhold i forhold til tidligere metoder20.
Updegraff-metoden er den mest anvendte metode til estimering af krystallinsk celluloseindhold. Denne metode blev første gang beskrevet af Updegraff til måling af cellulose i 196921. Updegraff-metoden integrerer Kurschner-metoden (anvendelse af salpetersyre), Kiesel- og Seminowsky-metoderne (hydrolyse af cellulose i glukosemonomerer ved hjælp af svovlsyre) med nogle modifikationer og anthronanalysen af Viles og Silverman for simpel kolorimetrisk estimering af glukose og krystallinsk celluloseindhold22. Princippet for denne metode er anvendelse af eddikesyre og salpetersyre (Updegraff reagens) til at fjerne hemicellulose og lignin fra det homogeniserede plantevæv, som efterlader eddikesyre/salpetersyreresistent cellulose til videre behandling og estimering15. Den eddikesyre-/salpetersyreresistente cellulose behandles med 67% svovlsyre for at bryde cellulose i glukosemonomerer, og de frigivne glukosemonomerer anslås ved anthronanalyse21,23. Flere ændringer af den oprindelige Updegraff-metode blev brugt til at forenkle proceduren og celluloseestimering ved anthronanalyse24. Generelt kan denne metode opdeles i fem faser. I den første fase fremstilles plantematerialet. I anden fase adskilles råcellevæggen fra den samlede biomasse, da cellulose er nøglekomponenten i plantecellevægge. Senere, i tredje fase, adskilles cellulose fra de ikke-celluloseholdige cellevægkomponenter ved at behandle med Updegraff reagens. I fjerde fase nedbrydes den eddikesyre-/salpetersyreresistente cellulose i glukosemonomerer ved svovlsyrebehandling. Svovlsyrebehandling af cellulose resulterer i dannelse af 5-hydroxymethylfurfuralforbindelser fra reaktionen af glukosemonomerer med svovlsyre. Endelig genererer antronen i den sidste fase et grønligt blåt kompleks ved kogning med furfuralforbindelsen genereret i den foregående fase25. Denne anthrone baserede kolorimetriske metode blev første gang brugt i 1942 af Dreywood. Anthron er et farvestof, der identificerer furfuralforbindelser af pentose og hexose dehydrerede produkter såsom 5-hydroxymethylfurfural under sure forhold. Reaktion med hexose producerer en intens farve og bedre respons i forhold til pentoses25. Mængden af bundet glukose måles ved spektrofotometerabsorptance ved 620 nm, og intensiteten af det grønlige blå kompleks er direkte proportional med mængden af sukker i prøven. De målte absorbansværdier blev sammenlignet med en regressionslinje for glukosekurven for at beregne prøvens glukosekoncentration. Det målte glukoseindhold blev anvendt til at estimere celleuloseindholdet i plantebiomassen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bomuldsfibre er naturlige fibre fremstillet af cottonseed. Bomuldsfiber er en enkelt celle med ~95% celluloseindhold2 med højt krystallinsk celluloseindhold med omfattende anvendelser i tekstilindustrien31. Som, bomuld fiber indeholder ~ 95% cellulose, har vi brugt bomuld rodvæv til påvisning af skøn over krystallinsk cellulose indhold. Rodvæv af bomuld er moderat rigt på krystallinsk celluloseindhold og repræsenterer en almindeligt tilgængelig plantebiomasse. Den m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Institut for Plant &Soil Science og Cotton Inc. for deres delvise støtte til denne undersøgelse.
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | A18-500 | Used in the protocol |
| Anthrone | Sigma Aldrich | 90-44-8 | For colorimetric assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifugation |
| Chloroform | Mallinckrodt | 67-66-3 | Used in the protocol |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | Used in the protocol |
| Ethanol | Millipore Sigma | EM-EX0276-4S | Used in the protocol |
| Filter paper | Whatman | 1004-090 | Positive control |
| Glacial acetic acid | Sigma | SKU A6283 | Used in the protocol |
| Heat block/ ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 13527550 | For controlled temperatures |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | Used for drying plant sample |
| Measuring Scale | Mettler Toledo | 30243386 | For specific quantities |
| Methanol 100 % | Fisher Chemical | A412-500 | Used in the protocol |
| Microplate (96 well) | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | For anthrone assay |
| Nitric acid | Sigma Aldrich | 695041 | Used in the protocol |
| Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes | BioSpec Products | 10831 | For high temperatures |
| Spectrophotometer(Multimode Detector) | Beckmancoulter DTX880 | 1000814 | For measuring absorbances |
| Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For grinding plant tissues into fine powder |
| Sulphuric acid | J.T.Baker | 02-004-382 | Used in the protocol |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | Used in the PSB buffer |
| Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Used in the protocol |
| Tris Hydrochloride | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | Used in the PSB buffer |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer (vacufuge plus) | Eppendorf | 22820001 | For drying samples |
| Vortex mixer | Fisherbrand | 14-955-151 | For mixing |
| Waterbath | Thermoscientific | TSGP02PM05 | For temperature controlled conditions at specific steps |
| Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12A | Used in the protocol |
References
- Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
- Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
- Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
- Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
- Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
- Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
- Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
- Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
- Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
- Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
- Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
- Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
- Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
- Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
- Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. . Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
- Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
- Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
- Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
- Salo, M. -. L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
- Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
- Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
- Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
- Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
- Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
- Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
- Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
- Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
- Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
- Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
- Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
- Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
- Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
- Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).
