इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य वाइब्रेम सेक्शनिंग का उपयोग करके माउस गुर्दे की श्रोणि के अक्षुण्ण पेसमेकर क्षेत्रों को अलग करना है। इन वर्गों का उपयोग सीटू सीए2 + इमेजिंग में पेसमेकर कोशिकाओं और वाइब्रेटोम स्लाइस में अन्य इंटरस्टिशियल कोशिकाओं के सीए2 + क्षणिक गुणों को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है।
गुर्दे की श्रोणि (आरपी) एक कीप के आकार का, चिकनी मांसपेशियों की संरचना है जो नियमित, प्रणोदक संकुचन द्वारा गुर्दे से मूत्र तक सामान्य मूत्र परिवहन की सुविधा प्रदान करती है। नियमित आरपी संकुचन पेसमेकर गतिविधि पर भरोसा करते हैं, जो श्रोणि-गुर्दे जंक्शन (पीकेजे) में आरपी के सबसे समीपस्थ क्षेत्र से निकलती है। पीकेजे की अक्षुण्ण तैयारी तक पहुंचने और संरक्षित करने में कठिनाई के कारण, आरपी पेसमेकिंग पर अधिकांश जांचों ने एकल-कोशिका इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और सीए2 + इमेजिंग प्रयोगों पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि आरपी पेसमेकिंग पर महत्वपूर्ण खुलासे इस तरह के काम से उभरे हैं, इन प्रयोगों में कई आंतरिक सीमाएं हैं, जिनमें मिश्रित निलंबन में सेलुलर पहचान को सही ढंग से निर्धारित करने में असमर्थता और आरपी पेसमेकर गतिविधि के सीटू इमेजिंग में कमी शामिल है । इन कारकों के परिणामस्वरूप सामान्य लयबद्ध आरपी संकुचन को कम करने वाले तंत्रों की सीमित समझ हुई है। इस पेपर में वाइब्रेटम सेक्शनिंग तकनीक का इस्तेमाल करते हुए माउस पीकेजे के अक्षुण्ण खंडों को तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। सेल-विशिष्ट संवाददाताओं और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + संकेतकों को व्यक्त करने वाले चूहों के साथ इस दृष्टिकोण को जोड़कर, जांचकर्ता सामान्य मूत्र परिवहन के लिए महत्वपूर्ण परिस्त आरपी संकुचन के लिए जिम्मेदार विशिष्ट सेल प्रकारों और तंत्रों का अधिक सटीक अध्ययन करने में सक्षम हो सकते हैं।
गुर्दे की श्रोणि (आरपी) एक कीप के आकार का, चिकनी मांसपेशियों की संरचना है जो मूत्र को गुर्दे से मूत्र तक पहुंचाती है। आरपी नियमितलयबद्ध संकुचन (पेरिस्टलसिस)1,2,3,4,5उत्पन्न करके मूत्र का परिवहन करता है, जो गुर्दे से मूत्राशय तक और अंततः मूत्राशय तक मूत्राशय तक मूत्र का एक बोलस को प्रेरित करता है, जहां इसे तब तक संग्रहीत किया जाता है जब तक कि यह6, 7होता है। इस नियमित गतिविधि के नुकसान के गंभीर परिणाम होते हैं, जिनमें हाइड्रोनेफ्रोसिस और गुर्दे की विफलता1,3,8शामिल हैं। इसलिए, नियमित, लयबद्ध आरपी संकुचन अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। पेरिस्टाल्टिक संकुचन आरपी-इन श्रोणि-गुर्देजंक्शन (पीकेजे)9,10, 11, 12, 13,14,15(चित्रा 1A–सी)के सबसे समीपस्थ क्षेत्र से उत्पन्न होते हैं और पिपिला से आरपी(चित्रा 1B)में मूत्र को पुश करने के लिए अलग-अलग प्रचारित करते हैं। पीकेजे मेंविद्युत पेसमेकर गतिविधि10, 11, 12, 13,15,16,17के रूप में पीकेजे में दर्ज की जाती है, जो विशेष पेसमेकर कोशिकाओं से उत्पन्न होती है। इन पेसमेकर कोशिकाओं, जिन्हें पहले असामान्य चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (एएसएमसी) कहा जाता है, को पेसमेकर गतिविधि उत्पन्न या समन्वित करने और “विशिष्ट” चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (एसएमसी) 9,10, 11, 18, 19,20,21,22,23के संकुचन को चलाने के लिए सोचाजाताहै।
एएसएमसी को पीकेजे(चित्रा 1ए–सी)में समीपस्थ आरपी में सबसे अधिक प्रचुर मात्रा में होता है, जहां पेरिस्टाल्टिक संकुचन और विद्युत पेसमेकर गतिविधि5,7,8,9,12,13,14,16,17,18,19,20, 21 से निकलती है ,22. इस समूह द्वारा हाल ही में प्रकाशित एक अध्ययन प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर-अल्फा (PDGFRα), चिकनी मांसपेशी मायोसिन भारी श्रृंखला (smMHC) के संयोजन में, इन इंटरस्टिशियल कोशिकाओं (आईसीएस)24के लिए एक अद्वितीय बायोमार्कर के रूप में, एक खोज है कि अंय समूहों द्वारा पुष्ट किया गया है की पहचानकी 25। उनके आकृति विज्ञान और प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न के आधार पर, इन कोशिकाओं को PDGFRα+ आईसी टाइप 1 (PIC1)24, 26कहाजाताथा । PIC1s पीकेजे की मांसपेशियों की परत में रहते हैं, जहां वे उच्च आवृत्ति, अल्पकालिक सीए2 + यात्रियों को प्रदर्शित करते हैं, जो पेसमेकर क्षमता24की पीढ़ी को रेखांकित करने के लिए सोचा था। हालांकि, अन्य सेल प्रकार पीकेजे में मौजूद हैं, जिनमें एडवेंटियल लेयर में गैर-एसएमएमएचसी-एक्सप्रेसिंग पीडीजीएफआरवाई+ आईसी (PIC2s) शामिल हैं। पिछली रिपोर्टों में सुझाव दिया गया है कि गैर-एसएमएमएचसी आईसीएस पेसमेकर गतिविधि19के नियमन में भाग ले सकते हैं । हालांकि, गैर-एसएमएमएचसी आईसीएस का आगे का अध्ययन सीए 2 + इमेजिंग अध्ययनके दौरान खराब अंतर से बाधित होता है। आमतौर पर, आरपी तैयारी के भीतर विषम कोशिका प्रकार को सीए2 + -संवेदनशीलरंगों (जैसे, फ्लू-4) से अंधाधुंध लोड किया जाता है। इन चुनौतियों से उबरने और आरपी में विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों का अध्ययन करने के लिए, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + संकेतक (जीईसीआई) का उपयोग सेल प्रकार के हित में सीए2 + –संवेदनशीलफ्लोरोफोरस को चुनिंदा रूप से व्यक्त करने के लिए किया जा सकता है।
PIC1s/ASMCsमें सीए2 + क्षणिक गुणों को स्पष्ट करने वाले अधिकांश अध्ययनों को फ्लैट-शीट आरपी ऊतक तैयारी19, 21,27इमेजिंग द्वारा प्राप्त किया गया था । चूंकि पीआईसी 1एस एसएमएमएचसी को व्यक्त करने के लिए पीकेजे में एकमात्र सेल प्रकार है, एसएमएमएचसी+ कोशिकाओं में जीईसीआई, जीसीएएमपी की सशर्त अभिव्यक्ति इस विन्यास में PIC1s का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है। हालांकि, जैसा कि PIC1s और PIC2s दोनों व्यक्त करते हैं PDGFRα, PDGFRα+ कोशिकाओं में GCaMP वेरिएंट की सशर्त अभिव्यक्ति फ्लैट शीट तैयारी में सेल भेद निषेध। इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, पीकेजे ऊतक दीवार24में PIC1s और PIC2s को अलग करने के लिए एक वाइब्रेटोम सेक्शनिंग दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। इन असतत सेलुलर आबादी को प्रकट करने के लिए, आरपी कोरोनली को खंडित किया गया था, जिससे ज्ञात इम्यूनोहिस्टोकेमिकल लेबलिंग और जीईसीआई अभिव्यक्ति पैटर्न के आधार पर मांसपेशियों की दीवार में एडवेंटिया और PIC1s में PIC2s की पहचान करना संभव हो गया था। इस उपन्यास पीकेजे इमेजिंग दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप, PIC1s और PIC2s अलग सीए2 + सिग्नलिंग गुण24प्रदर्शित करने के लिए पाए गए। इसके अलावा, पीकेजे क्षेत्र(चित्रा 2)के सबसे समीपस्थ वर्गों को अलग करके, आरपी के पेसमेकर क्षेत्र को इस तरह से संरक्षित किया गया था जो पहले पूरा नहीं किया गया था। यहां, एक प्रोटोकॉल को यह दिखाने के लिए वर्णित किया गया है कि वाइब्रेटम सेक्शनिंग का उपयोग करके माउस किडनी से पीकेजे की तैयारी को कैसे अलग किया जाए, सीए2 + इमेजिंग प्रयोगों के लिए इन तैयारियों को कैसे स्थापित किया जाए, और पीकेजे दीवार में विभिन्न सेल प्रकारों को कैसे अलग किया जाए।
आरपी विभिन्न आरपी क्षेत्रों में मनाया अंतर कोशिका घनत्व के साथ कोशिकाओं की एक विषम आबादी के होते हैं । PIC1s (पहले ASMCs के रूप में संदर्भित) पीकेजे में सबसे प्रचुर मात्रा में हैं, जहां पेसमेकर गतिविधि24निकलती है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल, जांचकर्ताओं को माउस गुर्दे के बाकी हिस्सों से पेसमेकर क्षेत्र को अलग करने की अनुमति देता है । एक वाइब्रेटोम का उपयोग करके पीकेजे के वर्गों को काटकर, आरपी के पेसमेकर क्षेत्रों (परेन्चिमा से जुड़े मांसपेशी बैंड के रूप में पहचाने जाते हैं) को बरकरार रखा जाता है, इस प्रकार सेल-विशिष्ट फ्लोरेसेंस रिपोर्टर्स के साथ संयुक्त होने पर आरपी पेसमेकर कोशिकाओं का सही अध्ययन करने के लिए सीटू इमेजिंग में उपयोग करना।
हालांकि यह दृष्टिकोण आरपी पेसमेकिंग में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है, कुछ विचार हैं जो प्रयोगकर्ताओं को इमेजिंग परिणामों और अनुभागिंग दक्षता में सुधार करने के लिए परिचित होना चाहिए। एक अप्रशिक्षित उपयोगकर्ता के लिए, पीकेजे अलगाव और इमेजिंग की यह विधि फ्लैट-शीट आरपी तैयारी के विशिष्ट तेज विच्छेदन की तुलना में सीखना आसान है। पूरे गुर्दे से आरपी के तेज विच्छेदन को शरीर विज्ञान प्रयोगों के लिए व्यवहार्य ऊतकों को सफलतापूर्वक अलग करने के लिए सप्ताह के लगातार अभ्यास की आवश्यकता होती है। चूंकि इस कंपन खंड प्रोटोकॉल के लिए थोड़ा तेज विच्छेदन ज्ञान की आवश्यकता होती है, यह उन उपयोगकर्ताओं के लिए सुलभ है जिनके पास अन्य चिकनी मांसपेशियों की संरचनाओं को विच्छेदन करने का अनुभव नहीं है।
हालांकि, इस प्रोटोकॉल के लिए ध्यान देने के लिए कुछ महत्वपूर्ण बिंदु हैं। कंपन नमूना प्लेट के लिए गुर्दे का सफलतापूर्वक पालन करने के लिए निपुणता और धैर्य की आवश्यकता होती है। यदि गुर्दे को गलत तरीके से केंद्रित किया जाता है और एक तरफ झुक जाता है, तो सीधे वर्गों के बजाय तिरछा काट दिया जाएगा। पीकेजे की नाजुक प्रकृति के कारण, तिरछा कोण अक्सर पेसमेकर क्षेत्र के मांसपेशियों के बैंड को नष्ट कर सकता है। इसके अलावा, तिरछे वर्गों की इमेजिंग के परिणामस्वरूप खराब इमेजिंग अधिग्रहण होता है क्योंकि सेल नेटवर्क आमतौर पर एक ही फोकल प्लेन में नहीं होते हैं। प्रक्रिया भी समय लेने वाली है, एक गुर्दे की खंडिंग के साथ अक्सर पूरा करने के लिए एक घंटे तक ले, जिसके दौरान सेटअप निगरानी की आवश्यकता है ।
जबकि वाइब्रेटम के आंदोलन को उड़ सकता है, यदि गति बहुत अधिक बढ़ जाती है (प्रोटोकॉल में अनुशंसित की तुलना में >20%), ब्लेड गुर्दे को सफाई से काटने के बजाय कटा होगा, जिसके परिणामस्वरूप नाजुक पीकेजे संरचनाओं का नुकसान होगा। इसी तरह, एक काटने की गति जो बहुत कम है, धारा दांतेदार हो सकती है। गति और ब्लेड आयाम काटने का अनुकूलन आवश्यक है। कंपन वर्गों को संभालने में भी सावधानी बरती जानी चाहिए। उनकी नाजुक प्रकृति के कारण, पीकेजे मांसपेशियों को संभालने के दौरान आसानी से बाधित किया जाता है और आंसू आ सकते हैं। एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित उपयोगकर्ता लगभग 1-2 पीकेजे क्षेत्रों प्रति 4 गुर्दे के स्लाइस को काटने में सक्षम होगा जो सीए2 + इमेजिंग प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं। आमतौर पर, पीकेजे अनुभाग जो सीए2 + इमेजिंग मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं: 1) गरीब GCaMP अभिव्यक्ति, 2) एक contorted PKJ दीवार, या 3) एक टूटी हुई पीकेजे दीवार। डेटा विश्लेषण के लिए, देखने के क्षेत्र प्रति लगभग 3-4 कोशिकाओं (FOV) नमूना जा सकता है ।
जबकि पीडीजीएफआरα-GCaMP6f और एसएमसी-जीसीएएमपी 3 पीकेजे वर्गों के एफओवी में कई कोशिकाएं हैं, छोटे ऊतक आंदोलन अक्सर विश्लेषण से कोशिकाओं को बाहर करते हैं। यह आमतौर पर छवियों के लिए एक स्थिरीकरण प्रोटोकॉल लागू करके हल किया जा सकता है। उन परिस्थितियों में जहां तैयारी नहीं होती है, कम से कम 3-5 कोशिकाओं का नमूना PDGFRα-GCaMP6f वर्गों और एसएमसी-जीसीएएमपी 3 वर्गों से 5-6 कोशिकाओं से लिया जा सकता है। आमतौर पर, पशु बलि से लिया गया समय (चूहों के लिए इष्टतम आयु 8-16 सप्ताह है) सीए2 + इमेजिंग प्रयोगों को करने के लिए 2-3 घंटे है, जो ऊतक अखंडता सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है, अगर आवश्यकता पड़ने पर प्रक्रिया के दौरान ऊतकों को बर्फ-ठंडे समाधानों में इनक्यूबेटेड किया जाता है। संक्षेप में, माउस किडनी से आरपी पीकेजे क्षेत्रों की अक्षुण्ण तैयारी उत्पन्न करने के लिए यहां एक वाइब्रेटोम कटिंग प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। यह तकनीक आरपी पेसमेकर तंत्र की जांच करने के लिए सीटू सीए2 + इमेजिंग अध्ययनों में आरपी पेसमेकर क्षेत्रों के संरक्षण की अनुमति देती है।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को एनआईडीडीके से R01 DK124509 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
24-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 142485 | To store kidney slices in |
35 mm x 10 mm Petri dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | Kidney slice calcium imaging dish |
48-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 152640 | To store kidney slices in |
60 mm x 15 mm Petri dish | Sigma Aldrich | P5481 | Kidney sharp dissection dish |
Absorbent paper | Fisher Scientific | 06-666A | To dry the kidney before applying glue |
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 13148 | GCaMP3 Mice |
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 24105 | GCaMP6f Mice |
B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J | The Jackson Laboratory | 19079 | smMHC-CRE Mice |
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J | The Jackson Laboratory | 13148 | PDGFRa-CRE Mice |
Cyanoacrylate glue | Amazon | B001PILFVY | For adhering the kidney to the specimen plate |
Ethanol | Phamco-Aaper | SDA 2B-6 | For dissection |
Extra-Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14083-08 | Used for internal dissecting scissors |
Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Used for external dissecting scissors |
Fine-tip forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Used for fine dissection of kidney |
Gillette Silver Blue double-edge blades | Amazon | B009XHQGYO | For insertion into blade holder of vibratome |
ImageJ | NIH | For calcium imaging analysis | |
Isoflurane | Baxter | NDC 1001936060 | For anesthesia |
Minutien pins | Fisher Scientific | NC9677548 | Pins were cut in half to reduce their length |
Silicon elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 |
Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | For gently holding and moving the kidney |
Student Dumont Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for internal dissecting forceps |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | For sharp dissection and cleanup of isolated kidney |
Vibrocheck | Leica | 14048142075 | Optional component for calibrating blade movement during cutting |
VT1200 S Vibrating Blade Microtome | Leica | 14912000001 | Configuration 1 is used in our protocol |