O objetivo deste protocolo é isolar regiões de marca-passo intactas da pelve renal do rato usando seção de vibratome. Essas seções podem então ser usadas para imagens in situ Ca2+ para elucidar propriedades transitórias ca2+ de células marcapassos e outras células intersticiais em fatias de vibratome.
A pelve renal (RP) é uma estrutura muscular lisa em forma de funil que facilita o transporte normal de urina do rim para o ureter por contrações regulares e propulsivas. As contrações regulares de RP dependem da atividade do marca-passo, que se origina da região mais proximal do RP na junção pélvis-renal (PKJ). Devido à dificuldade de acesso e preservação de preparações intactas do PKJ, a maioria das investigações sobre o pacemaking de RP se concentrou em eletrofisiologia unicelular e experimentos de imagem Ca2+. Embora revelações importantes sobre o pacemaking RP tenham emergido de tal trabalho, esses experimentos têm várias limitações intrínsecas, incluindo a incapacidade de determinar com precisão a identidade celular em suspensões mistas e a falta de imagens in situ da atividade do marca-passo RP. Esses fatores resultaram em uma compreensão limitada dos mecanismos que estão por trás das contrações normais de RP rítmico. Neste artigo, um protocolo é descrito para preparar segmentos intactos do PKJ do mouse usando uma técnica de secção de vibratome. Combinando essa abordagem com camundongos expressando repórteres específicos de células e indicadores ca2+ geneticamente codificados, os pesquisadores podem ser capazes de estudar com mais precisão os tipos e mecanismos específicos de células responsáveis pelas contrações peristálticas de RP que são vitais para o transporte normal de urina.
A pelve renal (RP) é uma estrutura muscular lisa em forma de funil que transporta urina do rim para o ureter. O RP transporta urina gerando contrações rítmica regulares (peristalse)1,2,3,4,5, que impulsiona um bolus de urina do rim distally para o ureter e, finalmente, para a bexiga, onde é armazenado até que ocorra a micturição6,7. A perda dessa atividade regular tem consequências terríveis, incluindo hidronefrose e insuficiência renal1,3,8; portanto, há uma necessidade crítica de estudar os mecanismos subjacentes às contrações regulares e rítmicas de RP. As contrações peristálticas originam-se da região mais proximal da junção pélvis-renal (PKJ)9,10,11,12,13,14,15 (Figura 1A–C) e propagam distalmente para empurrar urina da papila para o RP ( Figura1B). A atividade do marca-passo elétrico é registrada no PKJ como despolarizações transitórias espontâneas10,11,12,13,15,16,17, que são consideradas decorrentes de células-passo especializadas. Acredita-se que essas células marca-passo, antes chamadas de células musculares lisas atípicas (ASMCs), gerem ou coordenem a atividade do marca-passo e conduzam as contrações de células musculares lisas “típicas” (SMCs)9,10,11,18,19,20,21,22,23.
Os ASMCs são mais abundantes no RP proximal, no PKJ (Figura 1A–C),onde contrações peristálticas e atividade de marca-passo elétrico originam-se5,7,8,9,12,13,14,16,17,18,19,20,21 ,22. Um estudo publicado recentemente por este grupo identificou o receptor-alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRα), em combinação com a cadeia pesada de miosina muscular lisa (smMHC), como um biomarcador único para essas células intersticiciais (ICs)24, um achado que foi corroborado por outros grupos25. Com base em seu padrão de morfologia e expressão proteica, essas células foram chamadas PDGFRα+ IC tipo 1 (PIC1)24,26. Pic1s residem na camada muscular do PKJ onde exibem transitórios ca2+ de alta frequência, de curta duração, pensados para fundamentar a geração de potenciais marca-passo24. No entanto, existem outros tipos de células no PKJ, incluindo PDGFRα+ ICs (PIC2s) expressos não smMHC na camada adventienta. Relatórios anteriores sugerem que as ICs não-smMHC podem participar da regulamentação da atividade de marca-passo19. No entanto, um estudo mais aprofundado das ICs não-smHC é dificultado pela baixa distinção durante os estudos de imagem ca2+. Normalmente, os tipos de células heterogêneas dentro das preparações de RP são indiscriminadamente carregados com corantes sensíveis ao Ca2+(por exemplo, Fluo-4). Para superar esses desafios e estudar uma variedade de tipos de células no RP, indicadores ca2+ codificados geneticamente podem ser utilizados para expressar seletivamente fluoroforos sensíveis ca2 emtipos de interesse celular.
A maioria dos estudos que elucidam propriedades transitórias Ca2+ em PIC1s/ASMCs foram realizados por meio de preparações de tecido RP de folhas planas de imagem19,21,27. Como pic1s são o único tipo de célula no PKJ para expressar smMHC, a expressão condicional do GECI, GCaMP, em células smMHC+ é apropriada para estudar PIC1s nesta configuração. No entanto, como PIC1s e PIC2s expressam PDGFRα, a expressão condicional das variantes GCaMP em células PDGFRα+ proíbe a distinção celular em preparações de folhas planas. Para contornar essa questão, uma abordagem de seção de vibratome foi usada para distinguir PIC1s e PIC2s através da parede de tecido PKJ24. Para revelar essas populações celulares discretas, o RP foi seccionado coronally, possibilitando identificar PIC2s na adventitia e PIC1s na parede muscular com base na rotulagem imunohistoquímica conhecida e padrões de expressão GECI. Como resultado desta nova abordagem de imagem PKJ, pic1s e PIC2s foram encontrados para exibir distintas propriedades de sinalização Ca2+ 24. Além disso, ao isolar as seções mais proximais da região do PKJ (Figura 2),a região do marca-passo do RP foi preservada de forma que não havia sido realizada anteriormente. Aqui, um protocolo é descrito para mostrar como isolar as preparações de PKJ do rim do rato usando seção de vibratome, como configurar essas preparações para experimentos de imagem Ca2+ e como distinguir os diferentes tipos de células através da parede PKJ.
O RP consiste em uma população heterogênea de células com densidades celulares diferenciadas observadas em várias regiões de RP. Pic1s (anteriormente referidos como ASMCs) são mais abundantes no PKJ, onde a atividade do marca-passo se origina24. O protocolo, descrito aqui, permite que os investigadores isolem a região do marca-passo do resto do rim do rato. Ao cortar seções de PKJ usando um vibratome, as regiões de marca-passo do RP (identificadas como faixas musculares ligadas ao parenchyma) são mantidas intactas, permitindo assim o uso de imagens in situ para estudar com precisão células marcapassos RP quando combinadas com repórteres de fluorescência específicas de células.
Embora essa abordagem possa fornecer novas informações sobre o pacemaking de RP, existem algumas considerações com as que os experimentadores devem estar familiarizados para melhorar os resultados de imagem e a eficiência de secção. Para um usuário destreinado, este método de isolamento e imagem PKJ é mais fácil de aprender do que a dissecção afiada típica de preparações de RP de folhas planas. Dissecção acentuada de RP de rins inteiros requer semanas de prática consistente para isolar com sucesso tecidos viáveis para experimentos de fisiologia. Como este protocolo de secção vibratome requer pouco conhecimento de dissecção nítida, é acessível a usuários que não têm experiência em dissecar outras estruturas musculares lisas.
No entanto, há alguns pontos críticos a serem observados para este protocolo. A adesão com sucesso dos rins à placa do espécime vibratome requer destreza e paciência. Se o rim for orientado incorretamente e inclinar-se para um lado, oblíquo em vez de seções retas será cortado. Devido à natureza delicada do PKJ, o ângulo oblíquo pode muitas vezes destruir as faixas musculares da região do marca-passo. Além disso, a imagem de seções oblíquas resulta em má aquisição de imagens, pois as redes celulares não estão tipicamente no mesmo plano focal. O procedimento também é demorado, com a secção de um único rim muitas vezes levando até uma hora para ser concluída, período durante o qual a configuração requer monitoramento.
Enquanto o movimento do vibratome pode ser acelerado, se a velocidade for aumentada demais (>20% do que o recomendado no protocolo), a lâmina vai rasgar em vez de cortar o rim de forma limpa, resultando na perda de delicadas estruturas PKJ. Da mesma forma, uma velocidade de corte muito baixa pode fazer com que a seção fique irregular. A otimização da velocidade de corte e da amplitude da lâmina é essencial. Deve-se também ter cuidado no manuseio de seções vibratome. Devido à sua natureza delicada, os músculos PKJ são facilmente interrompidos durante o manuseio e podem rasgar. Um usuário bem treinado será capaz de colher aproximadamente 1-2 regiões PKJ por 4 fatias de rim que são adequadas para experimentos de imagem Ca2+. Normalmente, seções PKJ que não atendem aos critérios de imagem Ca2+ têm: 1) má expressão GCaMP, 2) uma parede PKJ contorcida, ou 3) uma parede PKJ quebrada. Para análise de dados, aproximadamente 3-4 células por campo de visão (FOV) poderiam ser amostradas.
Embora existam muitas células no FOV das seções PDGFRα-GCaMP6f e SMC-GCaMP3 PKJ, pequenos movimentos teciduais frequentemente excluem as células da análise. Isso geralmente pode ser resolvido aplicando um protocolo de estabilização às imagens. Em condições em que as preparações não se movam, pelo menos 3-5 células podem ser amostradas das seções PDGFRα-GCaMP6f e 5-6 células das seções SMC-GCaMP3. Normalmente, o tempo retirado do sacrifício animal (idade ideal para camundongos é de 8 a 16 semanas) para realizar experimentos de imagem Ca2+ é de 2-3 h, o que é adequado para garantir a integridade do tecido, se os tecidos forem incubados em soluções geladas durante todo o procedimento quando necessário. Em resumo, um protocolo de corte de vibratome foi descrito aqui para gerar preparações intactas das regiões RP PKJ do rim do rato. Esta técnica permite a preservação de regiões de marca-passo RP para estudos de imagem in situ Ca2+ para investigar mecanismos de marca-passo RP.
The authors have nothing to disclose.
Este projeto foi financiado por R01 DK124509 da NIDDK.
24-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 142485 | To store kidney slices in |
35 mm x 10 mm Petri dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | Kidney slice calcium imaging dish |
48-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 152640 | To store kidney slices in |
60 mm x 15 mm Petri dish | Sigma Aldrich | P5481 | Kidney sharp dissection dish |
Absorbent paper | Fisher Scientific | 06-666A | To dry the kidney before applying glue |
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 13148 | GCaMP3 Mice |
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 24105 | GCaMP6f Mice |
B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J | The Jackson Laboratory | 19079 | smMHC-CRE Mice |
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J | The Jackson Laboratory | 13148 | PDGFRa-CRE Mice |
Cyanoacrylate glue | Amazon | B001PILFVY | For adhering the kidney to the specimen plate |
Ethanol | Phamco-Aaper | SDA 2B-6 | For dissection |
Extra-Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14083-08 | Used for internal dissecting scissors |
Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Used for external dissecting scissors |
Fine-tip forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Used for fine dissection of kidney |
Gillette Silver Blue double-edge blades | Amazon | B009XHQGYO | For insertion into blade holder of vibratome |
ImageJ | NIH | For calcium imaging analysis | |
Isoflurane | Baxter | NDC 1001936060 | For anesthesia |
Minutien pins | Fisher Scientific | NC9677548 | Pins were cut in half to reduce their length |
Silicon elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 |
Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | For gently holding and moving the kidney |
Student Dumont Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for internal dissecting forceps |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | For sharp dissection and cleanup of isolated kidney |
Vibrocheck | Leica | 14048142075 | Optional component for calibrating blade movement during cutting |
VT1200 S Vibrating Blade Microtome | Leica | 14912000001 | Configuration 1 is used in our protocol |