Målet med detta protokoll är att isolera intakt pacemaker regioner i mus njurlymfknutor bäcken med vibratome sektionering. Dessa sektioner kan sedan användas för in situ Ca2 + avbildning för att klargöra Ca2 + övergående egenskaper hos pacemakerceller och andra interstitiella celler i vibratome skivor.
Njur bäckenet (RP) är en trattformad, smidig muskelstruktur som underlättar normal urintransport från njuren till urineter genom regelbundna, framstötande sammandragningar. Regelbundna RP-sammandragningar förlitar sig på pacemakeraktivitet, som härrör från den mest proximala regionen i RP vid bäcken-njurkorsningen (PKJ). På grund av svårigheten att komma åt och bevara intakta preparat av PKJ, de flesta undersökningar på RP pacemaking har fokuserat på encellig elektrofysiologi och Ca2 + bildframställning experiment. Även om viktiga avslöjanden om RP-pacemaking har uppstått från sådant arbete, har dessa experiment flera inneboende begränsningar, inklusive oförmågan att exakt bestämma cellulär identitet i blandade suspensioner och bristen på in situ-avbildning av RP pacemaker-aktivitet. Dessa faktorer har resulterat i en begränsad förståelse av de mekanismer som ligger till grund för normala rytmiska RP-sammandragningar. I det här dokumentet beskrivs ett protokoll för att förbereda intakta segment av mus PKJ med hjälp av en vibratome sektionering teknik. Genom att kombinera detta tillvägagångssätt med möss som uttrycker cellspecifika reportrar och genetiskt kodade Ca2 + -indikatorer, kan utredare mer exakt studera de specifika celltyper och mekanismer som ansvarar för peristaltiska RP-sammandragningar som är avgörande för normal urintransport.
Njurskinn (RP) är en trattformad, smidig muskelstruktur som transporterar urin från njuren till urinröret. RP transporterar urin genom att generera regelbundna rytmiska sammandragningar (peristalsis)1,2,3,4,5, som driver en bolus av urin från njuren distally till urinröret och slutligen till urinblåsan, där den lagras tills micturitionuppstår 6,7. Förlust av denna regelbundna verksamhet har allvarliga konsekvenser, inklusive hydronefen och njursvikt1,3,8; Därför finns det ett kritiskt behov av att studera mekanismerna bakom regelbundna, rytmiska RP-sammandragningar. Peristaltiska sammandragningar härrör från den mest proximala regionen i RP-in bäcken-njurkorsningen (PKJ)9,10,11,12,13,14,15 (Figur 1A–C) och förökar sig distally för att trycka urin från papillan in i RP (Figur 1B). Elektrisk pacemaker aktivitet registreras i PKJ som spontana övergående depolarizations10,11,12,13,15,16,17, som tros uppstå från specialiserade pacemaker celler. Dessa pacemakerceller, tidigare kallade atypiska släta muskelceller (ASMCs), tros generera eller samordna pacemakeraktivitet och driva sammandragningarna av “typiska” släta muskelceller (SMCs)9,10,11,18,19,20,21,22,23.
ASMCs är mest rikliga i den proximala RP, vid PKJ (Figur 1A–C), där peristaltic sammandragningar och elektrisk pacemaker verksamhet har sitt ursprung5,7,8,9,12,13,14,16,17,18,19,20,21 ,22. En nyligen publicerad studie av denna grupp identifierade trombocyt-härledd tillväxtfaktor receptor-alfa (PDGFRα), i kombination med glatt muskel myosin tung kedja (smMHC), som en unik biomarkör för dessa interstitiella celler (ICs)24, ett fynd som har bekräftats av andra grupper25. Baserat på deras morfologi och proteinuttrycksmönster kallades dessa celler PDGFRα+ IC typ 1 (PIC1)24,26. PIC1s ligger i muskelskiktet i PKJ där de visar högfrekventa, kortvariga Ca2 + transienter, som tros ligga till grund för generationens pacemakerpotentialer24. Det finns dock andra celltyper i PKJ, inklusive icke-smMHC-uttryck PDGFRα+ ICs (PIC2s) i det adventitiala skiktet. Tidigare rapporter har föreslagit att icke-SMMHC ICs får delta i regleringen av pacemakeraktivitet19. Ytterligare studier av icke-smMHC ICs hindras dock av dålig skillnad under Ca2 + imaging studier. Vanligtvis är heterogena celltyper inom RP-preparaten urskillningslöst laddade med Ca2 +-känsliga färgämnen (t.ex. Fluo-4). För att övervinna dessa utmaningar och för att studera en mängd olika celltyper i RP, kan genetiskt kodade Ca2 + indikatorer (GECIs) användas för att selektivt uttrycka Ca2 +-känsliga fluorforer i celltyper av intresse.
Majoriteten av studier som belyser Ca2 + övergående egenskaper i PIC1s / ASMCs uppnåddes genom bildbehandling platt-sheet RP vävnadspreparat19,21,27. Eftersom PIC1s är den enda celltypen i PKJ som uttrycker smMHC, är villkorligt uttryck för GECI, GCaMP, i smMHC+ celler lämpligt att studera PIC1s i denna konfiguration. Men som PIC1s och PIC2s båda uttrycker PDGFRα, villkorligt uttryck för GCaMP varianter i PDGFRα+ celler förbjuder cellskillnad i flat-sheet preparat. För att kringgå denna fråga användes en vibratome sektionering tillvägagångssätt för att skilja PIC1s och PIC2s över PKJ vävnad vägg24. För att avslöja dessa diskreta cellulära populationer, RP var sektionerade coronally, vilket gör det möjligt att identifiera PIC2s i adventitia och PIC1s i muskelväggen baserat på kända immunohistochemical märkning och GECI uttryck mönster. Som ett resultat av denna nya PKJ-bildbehandlingsmetod visade sig PIC1s och PIC2s visa distinkta Ca2 + signalegenskaper24. Genom att isolera de mest proximala delarna av PKJ-regionen (figur 2) bevarades dessutom pacemakerregionen i RP på ett sätt som inte hade uppnåtts tidigare. Här beskrivs ett protokoll för att visa hur man isolerar PKJ-preparat från mus njuren med hjälp av vibratome sektionering, hur man ställer in dessa preparat för Ca2 + bildframställning experiment och hur man skiljer de olika celltyperna över PKJ väggen.
RP består av en heterogen population av celler med differentiella celltätheter observerade i olika RP-regioner. PIC1s (tidigare kallade ASMCs) är de vanligaste i PKJ, där pacemakeraktiviteten har sitt ursprungi 24. Protokollet, som beskrivs här, tillåter utredare att isolera pacemakerregionen från resten av mus njuren. Genom att skära delar av PKJ med hjälp av en vibratome hålls pacemakerregionerna i RP (identifierade som muskelband kopplade till parenkym) intakta, vilket ger användning av in situ-avbildning för att noggrant studera RP pacemakerceller i kombination med cellspecifika fluorescensreportrar.
Även om den här metoden kan ge nya insikter om RP-tempo, finns det vissa överväganden som experimenterare bör känna till för att förbättra bildresultaten och sektionseffektiviteten. För en otränad användare är denna metod för PKJ-isolering och avbildning lättare att lära sig än typisk skarp dissekering av plattplåts RP-preparat. Skarp dissekering av RP från hela njurar kräver veckor av konsekvent praxis för att framgångsrikt isolera livskraftiga vävnader för fysiologiska experiment. Eftersom detta vibratome sektionering protokoll kräver lite skarp dissekering kunskap, Det är tillgängligt för användare som inte har erfarenhet av att dissekera andra smidiga muskelstrukturer.
Det finns dock några kritiska punkter att notera för detta protokoll. Framgångsrikt vidhäftande njurar till vibratome exemplar plattan kräver fingerfärdighet och tålamod. Om njuren är felaktigt orienterad och lutar åt ena sidan, kommer sneda snarare än raka sektioner att skäras. På grund av PKJ: s känsliga natur kan den sneda vinkeln ofta förstöra pacemakerregionens muskelband. Dessutom resulterar avbildning av sneda sektioner i dålig bildförvärv eftersom cellnätverk vanligtvis inte finns i samma fokalplan. Förfarandet är också tidskrävande, med sektionering av en enda njure som ofta tar upp till en timme att slutföra, under vilken tid installationen kräver övervakning.
Medan vibratomens rörelse kan påskyndas, om hastigheten ökas för mycket (>20% än vad som rekommenderas i protokollet), kommer bladet att strimla snarare än att rent skära njuren, vilket resulterar i förlust av känsliga PKJ-strukturer. På samma sätt kan en skärhastighet som är för låg orsaka att sektionen blir ojämn. Optimering av skärhastighet och bladamlitud är viktigt. Försiktighet måste också vidtas vid hantering av vibratomesektioner. På grund av deras känsliga natur störs PKJ-muskler lätt under hanteringen och kan riva. En välutbildad användare kommer att kunna skörda cirka 1-2 PKJ-regioner per 4 njurskivor som är lämpliga för Ca2 + bildexperiment. Vanligtvis har PKJ-sektioner som inte uppfyller Ca2 + avbildningskriterier: 1) dåligt GCaMP-uttryck, 2) en förkonterad PKJ-vägg eller 3) en trasig PKJ-vägg. För dataanalys kan cirka 3-4 celler per synfält (FOV) provtas.
Medan det finns många celler i FOV av PDGFRα-GCaMP6f och SMC-GCaMP3 PKJ avsnitt, små vävnad rörelser utesluter ofta celler från analys. Detta kan vanligtvis lösas genom att tillämpa ett stabiliseringsprotokoll på bilder. Under förhållanden där preparat inte rör sig kan minst 3-5 celler provtas från PDGFRα-GCaMP6f-sektioner och 5-6 celler från SMC-GCaMP3-sektioner. Vanligtvis är den tid det tar från djuroffer (optimal ålder för möss är 8-16 veckor) till att utföra Ca2 + bildframställningsexperiment 2-3 h, vilket är tillräckligt för att säkerställa vävnadsintegritet, om vävnader inkuberas i iskalla lösningar under hela proceduren vid behov. Sammanfattningsvis har en vibratome skärprotokoll beskrivits här för att generera intakta preparat av RP PKJ regioner från mus njure. Denna teknik gör det möjligt att bevara RP pacemaker regioner för in situ Ca2 + imaging studier för att undersöka RP pacemaker mekanismer.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt finansierades av R01 DK124509 från NIDDK.
24-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 142485 | To store kidney slices in |
35 mm x 10 mm Petri dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | Kidney slice calcium imaging dish |
48-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 152640 | To store kidney slices in |
60 mm x 15 mm Petri dish | Sigma Aldrich | P5481 | Kidney sharp dissection dish |
Absorbent paper | Fisher Scientific | 06-666A | To dry the kidney before applying glue |
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 13148 | GCaMP3 Mice |
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 24105 | GCaMP6f Mice |
B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J | The Jackson Laboratory | 19079 | smMHC-CRE Mice |
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J | The Jackson Laboratory | 13148 | PDGFRa-CRE Mice |
Cyanoacrylate glue | Amazon | B001PILFVY | For adhering the kidney to the specimen plate |
Ethanol | Phamco-Aaper | SDA 2B-6 | For dissection |
Extra-Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14083-08 | Used for internal dissecting scissors |
Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Used for external dissecting scissors |
Fine-tip forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Used for fine dissection of kidney |
Gillette Silver Blue double-edge blades | Amazon | B009XHQGYO | For insertion into blade holder of vibratome |
ImageJ | NIH | For calcium imaging analysis | |
Isoflurane | Baxter | NDC 1001936060 | For anesthesia |
Minutien pins | Fisher Scientific | NC9677548 | Pins were cut in half to reduce their length |
Silicon elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 |
Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | For gently holding and moving the kidney |
Student Dumont Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for internal dissecting forceps |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | For sharp dissection and cleanup of isolated kidney |
Vibrocheck | Leica | 14048142075 | Optional component for calibrating blade movement during cutting |
VT1200 S Vibrating Blade Microtome | Leica | 14912000001 | Configuration 1 is used in our protocol |