Détermination semi-quantitative de la densité des neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra des modèles de rongeurs à l’aide de l’analyse automatisée d’images
Summary
Ici nous présentons une méthode automatisée pour la détermination semi-quantitative du nombre dopaminergique de neurone dans le substantia nigra compacta de substantia de rat.
Abstract
L’estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra est une méthode clé dans la recherche préclinique sur la maladie de Parkinson. Actuellement, le comptage stéréologique non biaisé est la norme pour la quantification de ces cellules, mais il reste un processus laborieux et long, qui peut ne pas être réalisable pour tous les projets. Ici, nous décrivons l’utilisation d’une plate-forme d’analyse d’image, qui peut estimer avec précision la quantité de cellules étiquetées dans une région d’intérêt prédéfinie. Nous décrivons un protocole étape par étape pour cette méthode d’analyse dans le cerveau de rat et démontrons qu’il peut identifier une réduction significative des neurones positifs d’hydroxylase de tyrosine dus à l’expression du mutant α-synuclein dans le nigra de substantia. Nous avons validé cette méthodologie en comparant avec les résultats obtenus par stéréologie impartiale. Prise ensemble, cette méthode fournit un processus rapide et précis pour détecter les changements dans le nombre de neurones dopaminergiques, et convient donc à une détermination efficace de l’effet des interventions sur la survie cellulaire.
Introduction
La maladie de Parkinson (MP) est une maladie du mouvement neurodégénérative répandue caractérisée par la présence d’agrégats protéiques contenant de la α-synucléine (α-syn) et la perte préférentielle de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra pars compacta (SNpc)1. La quantification du nombre de neurones dopaminergiques est une partie essentielle de la recherche sur la MP, car elle permet d’évaluer l’intégrité du système nigrostriatal, fournissant ainsi un critère d’évaluation important pour évaluer l’efficacité des traitements modificateurs de la maladie potentiels. Actuellement, la norme pour la quantification du nombre de cellules est le comptage stéréologique non biaisé, qui utilise des sections transversales bidimensionnelles (2D) du tissu pour estimer les caractéristiques volumétriques dans les structures tridimensionnelles (3D)2,3,4. Les méthodes thétélogiques modernes basées sur la conception utilisent des procédures d’échantillonnage aléatoire complètes et appliquent des protocoles de comptage (connus sous le nom de sondes) pour éviter les artefacts potentiels et les erreurs systématiques, permettant une détection fiable des différences légèrement supérieures à la variation inter-animaux5. Tandis que la stéréologie fournit un outil analytique puissant pour des études histologiques in vivo, elle prend beaucoup de temps, suppose la préparation uniforme d’échantillon, et exige la validation à plusieurs étapes, qui peut avoir un impact de plus en plus l’efficacité de plus en plus exigée pour l’investigation translationnelle préclinique.
Les progrès technologiques récents de la science numérique permettent d’adopter de nouvelles applications pour des évaluations plus efficaces de la pathologie sans stéréomicroscope, tout en comblant un besoin de substitut de la stéréologie impartiale. Ces méthodes augmentent la vitesse, réduisent l’erreur humaine et améliorent la reproductibilité des techniques téréologiques6,7. HALO est l’une de ces plateformes d’analyse d’images pour l’analyse quantitative des tissus en pathologie numérique. Il comprend une variété de modules différents et rapporte des données d’expression morphologiques et multiplexées sur une base cellule par cellule à travers des sections entières de tissu utilisant des algorithmes de reconnaissance de formes. Le module FL cytonucléaire mesure la positivité immunofluorescente des marqueurs fluorescents dans le noyau ou le cytoplasme. Cela permet de signaler le nombre de cellules positives pour chaque marqueur et le score d’intensité pour chaque cellule. Le module peut être adapté pour fournir des mesures individuelles de la taille des cellules et de l’intensité, bien que cette fonctionnalité ne soit pas requise pour la quantification des neurones dopaminergiques.
Le but de cette étude est de vérifier cette méthode avec un modèle de rat α-syn à base de vecteur viral préalablement validé de neurodégénérescencenigrale 8,9,10. Dans ce modèle, le mutant humain A53T α-syn est exprimé dans le SNpc par injection stéréotaxique du sérotype hybride adéno-associé du virus 1/2 (AAV1/2), entraînant une neurodégénérescence significative sur une période de 6 semaines. Le SNpc non injecté contralatéral peut, dans certaines études, servir de contrôle interne pour le côté injecté. Plus communément, l’injection de vecteur vide AAV (AAV-EV) dans une cohorte témoin d’animaux est utilisée comme témoin négatif. Nous présentons un guide étape par étape pour estimer la densité des neurones dopaminergiques restant dans le SNpc injecté après 6 semaines à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image automatisé (Figure 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
L’évaluation fiable de l’intégrité du système dopaminergique dans les modèles précliniques de palladium est essentielle pour déterminer l’efficacité des traitements modificateurs de la maladie potentiels. Par conséquent, il est important de contrôler et de réduire au minimum les confusions potentielles qui peuvent réduire la fiabilité et la reproductibilité des données histopathologiques. Des résultats quantitatifs prudents peuvent fournir plus d’informations que les descriptions qualitatives ou s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier tout le personnel de l’Installation avancée de microscopie optique (AOMF) du Réseau universitaire de santé pour leur temps et leur aide dans l’élaboration de ce protocole.
Materials
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
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