Examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson-zèbre de maladie musculaire
Summary
La régénération des muscles squelettiques est entraînée par les cellules souches musculaires résidentes des tissus, qui sont altérées dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire.
Abstract
Le muscle squelettique a une capacité remarquable à se régénérer après une blessure, qui est entraînée par des cellules souches musculaires résidentes dans les tissus obligatoires. Après une blessure, la cellule souche musculaire est activée et subit une prolifération cellulaire pour générer un pool de myoblastes, qui se différencient ensuite pour former de nouvelles fibres musculaires. Dans de nombreuses conditions d’atrophie musculaire, y compris la dystrophie musculaire et le vieillissement, ce processus est altéré, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Le processus de régénération musculaire chez le poisson-zèbre est hautement conservé avec des systèmes mammifères fournissant un excellent système pour étudier la fonction et la régénération des cellules souches musculaires, dans des conditions d’atrophie musculaire telles que la dystrophie musculaire. Ici, nous présentons une méthode pour examiner la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire. La première étape consiste à utiliser une plateforme de génotypage qui permet de déterminer le génotype des larves avant de provoquer une blessure. Après avoir déterminé le génotype, le muscle est blessé à l’aide d’un coup de couteau à aiguille, après quoi la microscopie à lumière polarisante est utilisée pour déterminer l’étendue de la régénération musculaire. Nous fournissons donc un pipeline à haut débit qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de maladie musculaire du poisson-zèbre.
Introduction
Le muscle squelettique représente 30 à 50% de la masse corporelle humaine et est non seulement indispensable à la locomotion, mais il sert également d’organe métabolique et de stockage critique1. Bien qu’il soit postmitotique, le muscle squelettique est très dynamique et conserve une énorme capacité de régénération après une blessure. Ceci est attribué à la présence de cellules souches résidentes tissulaires (également appelées cellules satellites), situées sous la lame basale des myofibres et marquées par les facteurs de transcription appariés boîte protéine 7 (pax7) et / ou protéine boîte appariée 3 (pax3), entre autres2,3. Après une blessure, la cellule satellite est activée et subit une prolifération cellulaire pour générer un pool de myoblastes, qui se différencient ensuite pour former de nouvelles fibres musculaires. La cascade hautement conservée de signaux pro-régénératifs régulant l’activation des cellules satellites et la réparation musculaire robuste est affectée dans diverses conditions telles que les myopathies et le vieillissement homéostatique4,5.
L’un de ces groupes diversifiés de myopathies est la dystrophie musculaire, caractérisée par une atrophie musculaire progressive et une dégénérescence6. Ces maladies sont la conséquence de mutations génétiques dans des protéines clés, dont la dystrophine et la laminine-α2 (LAMA2), responsables de la fixation des fibres musculaires à la matrice extracellulaire7,8. Étant donné que les protéines impliquées dans la dystrophie musculaire jouent un rôle central dans le maintien de la structure musculaire, on a cru pendant de nombreuses années qu’un échec de ce processus était le mécanisme responsable de la pathogenèse de la maladie9. Cependant, des études récentes ont identifié des défauts dans la régulation des cellules souches musculaires et une altération ultérieure de la régénération musculaire comme deuxième base possible pour la pathologie musculaire observée dans la dystrophie musculaire10,11. En tant que tel, d’autres études sont nécessaires pour étudier comment une altération de la fonction des cellules souches musculaires et des éléments de niche associés contribue à la dystrophie musculaire.
Au cours de la dernière décennie, le poisson-zèbre(Danio rerio)est devenu un modèle important de vertébrés pour la modélisation des maladies12. Ceci est attribué au développement externe rapide de l’embryon de poisson zèbre, associé à sa clarté optique, qui permet la visualisation directe de la formation, de la croissance et de la fonction musculaires. De plus, non seulement le développement et la structure des muscles sont hautement conservés chez le poisson-zèbre, mais ils présentent également un processus de régénération musculaire hautement conservé13. Par conséquent, le poisson-zèbre représente un excellent système pour étudier la pathobiologie des maladies musculaires et explorer comment la régénération musculaire y est affectée. À cette fin, nous avons développé une méthode qui permet l’étude opportune de la régénération musculaire squelettique dans les modèles de maladie musculaire du poisson-zèbre. Ce pipeline à haut débit implique une méthode de génotype d’embryons vivants14, à la suite de laquelle une blessure à l’aiguille est effectuée et l’étendue de la régénération musculaire est imagée à l’aide de la microscopie à lumière polarisante. L’utilisation de cette technique révélera donc la capacité de régénération du muscle dans les modèles de maladie musculaire du poisson-zèbre.
Protocol
Representative Results
Discussion
La régénération des muscles squelettiques est entraînée par des cellules souches musculaires résidentes des tissus obligatoires, dont la fonction est altérée dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, entravant par la suite le processus de régénération musculaire. Ici, nous décrivons un protocole à haut débit pour examiner la régénération musculaire dans des modèles vivants de poisson zèbre de maladie musculaire. La première étape du pipeline utilise une plate-forme …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr Alex Fulcher et Monash Micro Imaging pour leur aide à la maintenance et à la configuration du microscope. L’Australian Regenerative Medicine Institute est soutenu par des subventions du gouvernement de l’État de Victoria et du gouvernement australien. Ce travail a été financé par une subvention de projet de la Muscular Dystrophy Association (USA) à P.D.C (628882).
Materials
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
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