Summary
Este protocolo detalha uma investigação das interações iniciais entre células epiteliais nasais infectadas viralmente e ativação celular inata. Subconjuntos individuais de células imunes podem ser distinguidos com base em sua ativação em resposta a infecções virais. Eles podem então ser investigados para determinar seus efeitos sobre as respostas antivirais precoces.
Abstract
As interações precoces entre a camada epitelial nasal e as células imunes inatas durante infecções virais permanecem uma área pouco explorada. A significância da sinalização de imunidade inata em infecções virais aumentou substancialmente à medida que pacientes com infecções respiratórias que apresentam alta ativação de células T inatas mostram um melhor desfecho da doença. Assim, dissecar essas interações imunológicas inatas precoces permite a elucidação dos processos que os regem e pode facilitar o desenvolvimento de potenciais alvos terapêuticos e estratégias para amortecer ou mesmo prevenir a progressão precoce de infecções virais. Este protocolo detalha um modelo versátil que pode ser usado para estudar o crosstalk precoce, interações e ativação de células imunes inatas a partir de fatores secretados por células epiteliais viralmente infectadas pelas vias aéreas. Utilizando um vírus de influenza H3N2 (A/Aichi/2/1968) como modelo representativo do vírus, a ativação celular inata de células mononucleares periféricas co-cultivadas (PBMCs) foi analisada usando citometria de fluxo para investigar os subconjuntos das células que são ativadas pelos fatores solúveis liberados do epitélio em resposta à infecção viral. Os resultados demonstram a estratégia de diferenciação dos subconjuntos das células e revelam as diferenças claras entre as populações ativadas de PBMCs e seu crosstalk com o controle e epitélio infectado. Os subconjuntos ativados podem então ser analisados para determinar suas funções, bem como alterações moleculares específicas das células. Os achados de tal investigação de crosstalk podem descobrir fatores importantes para a ativação de populações celulares inatas vitais, que são benéficas no controle e na supressão da progressão da infecção viral. Além disso, esses fatores podem ser universalmente aplicados a diferentes doenças virais, especialmente em vírus recém-emergentes, para amortecer o impacto desses vírus quando circulam pela primeira vez em populações humanas ingênuas.
Introduction
Os vírus respiratórios estão talvez entre os patógenos mais difundidos que causam cuidados de saúde graves e carga econômica. Desde os surtos globais periódicos de cepas epidêmicas emergentes (por exemplo, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) até as cepas sazonais da gripe todos os anos, os vírus são uma ameaça constante à saúde pública. Embora as vacinas formem a maior parte da resposta a esses desafios globais de saúde pública, é preocupante notar que essas contramedidas sãomeramente responsivas 1,2. Além disso, um atraso entre o surgimento de uma nova cepa infecciosa e o desenvolvimento bem-sucedido de sua vacina é inevitável3, levando a um período em que as medidas disponíveis para conter a propagação do vírus são altamente limitadas.
Esses atrasos são ainda mais enfatizados pelos custos que são infligidos à sociedade economicamente e socialmente. Só a gripe sazonal é responsável por aproximadamente US$ 8 bilhões em custos indiretos, US$ 3,2 bilhões em custos médicos e 36,3 mil mortes nos Estados Unidos da América anualmente4. Isso é antes da consideração dos custos de pesquisa necessários para financiar o desenvolvimento de vacinas. Surtos epidêmicos têm efeitos ainda mais graves na sociedade, agravados pelo aumento da taxa de globalização a cada ano, como evidenciado pelas perturbações globais causadas pelo surgimento e rápida disseminação da síndrome respiratória aguda grave coronovírus 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
Estudos recentes têm mostrado que pacientes infectados com maior população de células T inatas ativadas tendem a ter um melhor desfecho da doença 8,9,10. Além disso, a população de células T inatas é categorizada em múltiplos subgrupos: as células invariantes associadas à mucosa T (MAIT), células Vδ1 γδ T, células Vδ2 γδ T e as células T (NKT) assassinas naturais. Esses subgrupos de células T inatas também apresentam heterogeneidade dentro de suas populações, aumentando a complexidade das interações entre as populações celulares envolvidas na resposta imune inata11. Assim, o mecanismo que ativa essas células T inatas e o conhecimento dos subgrupos específicos de células T inatas podem fornecer uma via diferente de pesquisa para reduzir os efeitos infecciosos desses vírus no hospedeiro humano, especialmente durante o período de desenvolvimento vacinal.
As células epiteliais infectadas pela gripe produzem fatores que ativam rapidamenteas células T inatas 12,13,14. Com base nessa descoberta, este modelo de co-cultura de Interface Ar-Líquido (ALI) sem contato tem como objetivo imitar as interações químicas iniciais (mediadas por fatores solúveis liberados pela camada epitelial infectada) entre a camada epitelial nasal infectada e os PBMCs durante a infecção precoce. A separação física entre a camada epitelial nasal (cultivada nas pastilhas de membrana) e os PBMCs (na câmara inferior) e a integridade epitelial previne a infecção direta dos PBMCs pelo vírus, permitindo um estudo detalhado dos efeitos dos fatores solúveis derivados da epitelial nos PBMCs. Os fatores identificados podem, portanto, ser investigados por seu potencial terapêutico em induzir a população de células T inatas apropriadas que possam proteger contra a infecção por gripe. Este artigo, portanto, detalhou os métodos de estabelecer uma cocultura para o estudo da ativação inata de células T a partir de fatores solúveis derivados do epitélio.
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Protocol
NOTA: Consulte a Tabela 1 para receitas de mídia utilizadas neste protocolo.
NOTA: o hNECS cultivado em transwell de 12 poços foi encontrado para crescer em espessura mais ideal para fatores solúveis para chegar à câmara basal prontamente quando infectados com o vírus influenza. Por isso, recomenda-se o uso de transwell de 12 bem dimensionados para a cocultura.
1. Estabelecimento da camada alimentador 3T3
- Estabelecimento de estoques congelados
- Descongele um criovial de fibroblastos NIH/3T3 de estoques congelados. Adicione o conteúdo do criovial a 2 mL de DMEM (Minimal Essential Media, mídia essencial mínima) da Dulbecco e resuspenque as células.
- Centrifugar por 5 min a 300 × g e temperatura ambiente/pressão (rtp), e remover o sobrenatante. Resuspenda as células em DMEM completo.
- Conte as células usando manchas azuis de tripano. Adicione 10 μL de trippan azul a 10 μL da suspensão da célula resuspended. Misture bem e adicione 10 μL da suspensão a um hemótmetro para contar as células.
- Células de sementes a uma densidade de 1 × 104 células/cm2 em um prato de cultura apropriado (por exemplo, frasco T75). Incubar o frasco de cultura resultante por 3 dias a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5%.
- Tratamento mitomicina C
- Aos 3 dias, certifique-se de que a confluência seja de 60%-80%, remova o meio e lave as células com soro fisiológico tamponado de fosfato 1x (PBS).
NOTA: É importante que a camada de alimentador 3T3 não atinja a confluência total; caso contrário, o tratamento mitomicina C não será eficaz. - Adicione dMEM completo suplementado por mitomicina C ao frasco e incubar por 3,5 h a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5%. Remova o meio contendo mitomicina C e lave as células 2x com 1x PBS.
- Aos 3 dias, certifique-se de que a confluência seja de 60%-80%, remova o meio e lave as células com soro fisiológico tamponado de fosfato 1x (PBS).
- Semeadura de células 3T3 em placas de 6 poços
- Adicione 3 mL de 1x trypsin-EDTA ao frasco por 3-5 min para desassociar as células. Colete as células dissociadas em um tubo fresco de 15 mL. Centrifugar o tubo de 15 mL por 5 min a 300 × g, rtp; descartar o supernatante. Resuspenda as células em DMEM completo.
- Conte as células usando manchas azuis de tripano. Semente as células em uma placa de 6 poços a 7,5 × 10 5-2,5 × 106 células/bem. Incubar a placa durante a noite a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2.
NOTA: A camada de alimentador 3T3 é considerada pronta se as células estiverem saudáveis. Neste ponto, semeou as células-tronco/progenitoras epiteliais nasais humanas (hNESPCs) na camada alimentadora para expansão. - Adicione DMEM completo ao frasco e incubar a 37°C, 5% DE CO2 durante a noite para as células 3T3 se recuperarem do tratamento mitomicina C.
2. Estabelecimento da cultura da célula epitelial nasal humana (hNEC)
NOTA: As amostras clínicas devem ser obtidas de pacientes livres de sintomas de infecção do trato respiratório superior.
- Processamento de tecido nasal em suspensão unicelular
- Lave o tecido nasal no PBS (dPBS) de Dulbecco (PBS) (PBS sem Mg2+ e Ca2+) contendo 100 μL/mL de uma mistura antibiótico-antimíctico. Corte o tecido em pequenos fragmentos e trate a amostra em 10 mg/mL de uma protease neutra durante a noite a 4 °C com agitação.
- Centrifugar por 5 min a 200 × g, e remover o sobrenatante após centrifugação. Incubar a pelota em 1-2 mL de 1x trypsin-EDTA (37 °C, 15 min), e saciar adicionando um volume de soro bovino fetal igual a 10% do volume no tubo.
- Dissociar mecanicamente o tecido digerido em agregados unicelulares por pipetação, e então passar a suspensão resultante através de um coador de células de 70 μm. Resuspenda as células em DMEM completo.
NOTA: Após esta etapa, a suspensão celular é uma mistura de células terminais diferenciadas e células-tronco que são referidas como células-tronco/progenitoras nasais humanas (hNESPCs). O objetivo das etapas subsequentes é selecionar e enriquecer a população do HNESPC a partir da mistura de diferentes populações celulares.
- Semeadura de uma suspensão de célula única na camada alimentador 3T3 para seleção de hNESPCs
- Centrifugar a suspensão celular da etapa 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp), e remover o sobrenante. Resuspense as células em 3-5 mL de média 3.
NOTA: O Medium 3 é formulado para promover o crescimento seletivo dos hNESPCs. - Conte as células através de coloração azul trypan. Semente 1 x 106 células em 2mL de média 3 por poço em placa de 6 poços contendo camada de alimentador 3T3 preparada após a remoção da mídia na placa de 6 poços. Incubar a cocultura resultante a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5%.
NOTA: Após a semeadura, tome cuidado para não agitar a placa, pois ela afetará a fixação dos hNESPCs. - Troque o médio 3 (2 mL) a cada 2-4 dias, removendo o médio antigo inteiramente e substituindo-o por meio fresco 3.
NOTA: O médio é alterado para repor nutrientes e para evitar que condições excessivamente ácidas influenciem negativamente o crescimento dos hNESPCs. O intervalo entre cada mudança média depende de quão ácido (amarelo) o meio se torna. Os intervalos devem ser encurtados se o meio se tornar ácido rapidamente. - Após 7-10 dias, observe que os hNESPCs estão em uma confluência adequada para transferi-los para as pastilhas de membrana. Consulte a Figura 1 para morfologia representativa de hNESPCs em 3 horários diferentes (2 dias, 5 dias e 10 dias).
- Centrifugar a suspensão celular da etapa 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp), e remover o sobrenante. Resuspense as células em 3-5 mL de média 3.
- Transferência de hNESPCs para pastilhas de membrana
NOTA: Devido ao tratamento da mitomicina C, a camada alimentador 3T3 se degradará lentamente durante o período de expansão do hNESPC. Isso resultará em uma adesão enfraquecida à superfície do poço, permitindo seu desalojamento lavando-se com uma pipeta, deixando para trás apenas os hNESPCs saudáveis.- Retire o meio e adicione 500 μL de 1x dPBS a cada poço. Lave as células 3x com uma micropipette para desalojar as células 3T3 e descartar o 1x dPBS. Observe sob o microscópio que os hNESPCs redondos permanecem enquanto a camada alimentador 3T3 em forma de fuso é desalojada.
- Adicione 500 μL de um reagente de dissociação celular por poço, e incubar a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5% por 5-10 min, ou até que os hNESPCs tenham se destacado da superfície do poço.
- Colete a suspensão hNESPC, centrífuga (300 × g, 5 min, rtp) e remova o supernaspeso.
- Resuspenda a pelota em média 3. Conte as células através de coloração azul trypan. Semente 3 × 104 células em 150 μL de inserção média 3 por membrana (placa de 24 poços) ou 1 × 105 células em 300 μL de média 3 por inserção de membrana (placa de 12 poços) (Figura 2). Incubar as células a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 .
- Troque o médio (médio 3) das câmaras apical e basal a cada 2 dias. Navegue por uma ponta de pipeta entre os braços de suporte da pastilha de membrana para acessar a câmara basal, remova o meio antigo e, em seguida, reintroduza o meio fresco pelo mesmo método. Embora a câmara apical seja facilmente acessível, tome cuidado para não perturbar a crescente camada hNESPC.
NOTA: Não perturbe o meio na câmara apical por pelo menos 2 dias após a semeadura, pois as células precisam de tempo para se prender à membrana.
- Diferenciação dos hNESPCs em hNECs
- Quando os hNESPCs atingem 100% de confluência (aproximadamente 3-7 dias a partir da semeadura na pastilha da membrana), inicie a cultura ALI. Altere o meio basal para o meio de diferenciação e remova o meio da câmara apical. Basta adicionar meio à câmara basal sem adicioná-la à câmara apical ao alterar o meio a cada 2-3 dias, conforme indicado na Figura 3 e etapa 2.3.5.
NOTA: O meio é alterado para meio de diferenciação para promover a diferenciação dos hNESPCs em hNECs em ALI. Os hNESPCs levam aproximadamente 3-4 semanas para atingir a maturidade total para se tornarem hNECs em ALI, momento em que as células teriam se tornado uma multicamadas com diferentes populações de células em cada camada. Cília também deve ser observada em uma ampliação de 400x (cílio pode ser identificado pelo seu movimento de espancamento, o que faz com que o campo de microscópio pareça estar vibrando). Neste ponto, as células estão prontas para serem usadas para os experimentos de co-cultura. Consulte a Figura 4 para obter a seção transversal de uma camada hNEC totalmente diferenciada. - Depois de obter hNECs maduros, lave as células na câmara apical 3x com 1x dPBS em intervalos de 2-3 dias durante uma semana antes do experimento de cocultura. Sinergize a etapa de lavagem com as alterações do meio basal e realize as lavagens da seguinte forma.
- Adicione 50 μL (24-bem)/150 μL (12-bem) de 1x dPBS na câmara apical da inserção da membrana e incubar as células a 37 °C por 10 min. Remova o dPBS após 10 minutos de incubação para remover muco acumulado e células mortas ao longo da diferenciação.
NOTA: Dependendo da natureza do experimento, a solução de bicarbonato de sódio pode ser usada para lavar totalmente a camada de muco. No entanto, para infecção viral em experimentos de cocultura, a camada de muco é retida, e apenas o excesso de muco é removido com lavagem dPBS. Esta retenção é para imitar a camada fisiológica do muco presente na epitélia nasal que vai interagir com a infecção viral que se entrada.
- Adicione 50 μL (24-bem)/150 μL (12-bem) de 1x dPBS na câmara apical da inserção da membrana e incubar as células a 37 °C por 10 min. Remova o dPBS após 10 minutos de incubação para remover muco acumulado e células mortas ao longo da diferenciação.
- Quando os hNESPCs atingem 100% de confluência (aproximadamente 3-7 dias a partir da semeadura na pastilha da membrana), inicie a cultura ALI. Altere o meio basal para o meio de diferenciação e remova o meio da câmara apical. Basta adicionar meio à câmara basal sem adicioná-la à câmara apical ao alterar o meio a cada 2-3 dias, conforme indicado na Figura 3 e etapa 2.3.5.
3. Medição da resistência elétrica transeptelial (TEER)
NOTA: A confirmação da integridade epitelial é importante para garantir que uma camada epitelial intacta e saudável seja obtida. Uma camada epitelial intacta é determinada através da medição teer realizada em 4 poços aleatórios usando um voltohmômetro.
- Enxágüe o eletrodo com 70% de etanol e esterilize-o com luz ultravioleta por 15 minutos antes de usar para garantir a esterilidade. Enxágüe com 1x dPBS após a esterilização.
- Adicione 100 μL (para 24-bem) ou 300 μL (para 12-bem) de 1x dPBS à câmara apical da inserção da membrana. Incubar a placa a 37 °C por 10 min; em seguida, remova o dPBS.
- Para cada poço a ser medido, prepare um bem nãoutilado com 1 mL (para 24-bem) ou 3 mL (para 12-bem) de meio de diferenciação pré-equipado (a 37 °C). Coloque a inserção de membrana no poço preparado e adicione 200 μL (para 24-bem) ou 600 μL (para 12-bem) de meio de diferenciação pré-armado à câmara apical. Equilibre a 37 °C (sujeito à temperatura de incubação do tipo de vírus adicionado, por exemplo, 35 °C para Influenza) por 15 min.
NOTA: Prepare um branco (inserção de membrana vazia) da mesma forma para o cálculo do TEER. - Equilibre um tubo de 15 mL de meio de diferenciação pré-armado na mesma temperatura por 15 min também. Coloque os eletrodos no tubo de 15 mL e ligue o voltohmômetro.
NOTA: Neste ponto, a leitura deve ser de 0 resistência, pois os eletrodos estão no mesmo meio. Se alguma outra leitura for obtida, equilibre o eletrodo no tubo de 15 mL até que a leitura seja 0. - A partir do espaço em branco, posicione os eletrodos em cada poço de tal forma que um eletrodo esteja submerso no meio da câmara apical e o outro no meio da câmara basal. Registo a leitura somente quando uma leitura constante é obtida por um período de pelo menos 5 minutos.
- Após cada medição, lave o eletrodo com PBS antes da próxima medição. Para cada poço testado, faça medições para três amostras em diferentes posições da membrana. Para calcular o TEER líquido de cada amostra, subtraia a resistência de fundo, dada pela inserção da membrana em branco, a partir de cada medição.
- Calcule a leitura total do TEER para um poço usando a seguinte equação:
Integridade Epitelial (Ωcm2) = Net TEER(ohms) × Área da membrana (cm2)
NOTA: Os valores teer de hNECs para experimentos de infecção viral devem ser >1000 Ωcm2 13,15,16.
4. Isolamento de monócitos sanguíneos periféricos e células NK
NOTA: As amostras de sangue devem ser obtidas de voluntários saudáveis e usadas no mesmo dia do isolamento.
- Coletar 30-40 mL de sangue inteiro de cada doador em tubos de coleta de sangue de 10 mL.
- Isole os PBMCs usando centrifugação de gradiente de densidade e obtenha PBMCs da camada buffy após os passos seguintes (veja também a Tabela de Materiais).
- Misture completamente ~10 mL de sangue do tubo de coleta de sangue em um vacutainer antes de diluir com um volume igual de solução de sal balanceada (PBS).
- Adicione 15 mL de gradiente de densidade médio à base de um tubo de 50 mL.
NOTA: A razão entre o gradiente de densidade e o sangue diluído devem ser de 2:3-3.5. - Camada 35 mL de sangue diluído no meio gradiente de densidade com uma pistola pipeta (com a configuração de dispensa definida para o mais baixo possível) inclinando o tubo em 45° e permitindo que o sangue diluído caia de forma gota na parede interna do tubo para que a camada de gradiente de densidade não seja perturbada.
- Centrifugar lysate a 500 × g, 18-20 °C por 30 min (freio: desligado). Remova e descarte cuidadosamente a camada de plasma superior sem perturbar a camada inferior.
- Transfira a camada de buffy para um novo tubo sem misturar a camada de glóbulos vermelhos, a camada média de densidade gradiente ou a camada buffy. Uma vez que o casaco buffy tenha sido coletado em um novo tubo de 50 mL, cubra o volume para 50 mL com 1x PBS.
- Centrifugar lysate a 800 × g, 18-20 °C, 8 min (freio: desligado) e remover o sobrenatante com uma arma de pipeta. Resuspenque a pelota celular com 50 mL de 1x PBS, e centrífuga a 120 × g, 18-20 °C, 10 min para remover plaquetas.
- Descarte o supernatante por pipetação, sem perturbar a pelota celular.
NOTA: Como a pelota de célula pode estar solta, é desaconselhável descartar o supernatante derramando. - Resuspend a pelota celular com meio RPMI completo (Roswell Park Memorial Institute). Realize uma contagem celular adicionando 10 μL de ácido acético de 3% com azul de metileno a 10 μL da suspensão celular resuspended. Misture bem e adicione 10 μL da mistura a um hemótmetro para contar as células.
- PBMCs diluídos com meio RPMI completo a uma densidade de 2 × 106/mL (para 24-bem) ou 4 × 106/mL (para 12-bem).
5. hNEC Infecção viral e transição para hNEC:PBMC co-cultura
NOTA: H3N2 (A/Aichi/2/1968) é usado como a cepa representativa da infecção neste protocolo. A multiplicidade de infecção (MOI) de 0.1 é utilizada como moi representativa neste protocolo.
- Dia 0 (Infecção de hNECs)
NOTA: Um poço dos hNECs cultivados a partir do mesmo doador é usado para obter uma contagem de células representativa para cada bem utilizado no experimento.- No bem representativo, adicione 150 μL de 1x trypsin-EDTA à câmara apical da inserção da membrana e 350 μL de 1x trypsin-EDTA à câmara basal, e incubar a 37 °C por 10 minutos, ou até que as células se desprendem da membrana.
- Lave as células na membrana tubondo para cima e para baixo, e colete a suspensão em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Adicione 200 μL de DMEM completo para saciar a atividade de trypsin. Conte células através de coloração azul trypan para obter a contagem de células por poço.
- Calcule o MOI necessário do vírus com base na contagem de células por poço, e dilua o estoque do vírus de acordo com o RPMI completo no gelo.
NOTA: MOI 0.1 de 1,26 × 106 hNECs por poço = 1,26 × 105 H3N2 partículas virais por poço em 30 μL (para 24-well)/100 μL (para 12-bem) - Para os demais poços para o experimento de infecção, adicione 50 μL (para 24-bem)/150 μL (para 12-bem) de 1x dPBS nas câmaras apical das pastilhas de membrana, incubar a 37 °C por 10 minutos e remover o 1x dPBS.
- Altere o meio basal nas pastilhas de membrana para completar o meio RPMI transferindo as pastilhas para uma nova placa com RPMI completo adicionado aos poços (350 μL (para 24-bem)/700 μL (para 12-bem)).
NOTA: Quando os hNESPCs têm totalmente diferenciado para os hNECs, eles são tolerantes/permissivos a diferentes mídias por até 72 h, sem alterações na morfologia ou organização quando o meio é trocado para RPMI12. O RPMI é usado para apoiar o crescimento e manutenção da população do PBMC. - Adicione o inóculo preparado de 30 μL (para 24-bem)/100 μL (para 12-bem) do inóculo do vírus na câmara apical da inserção da membrana, incubar a 35 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 1 h, e remover o inóculo viral da câmara apical.
- Mude o meio basal da inserção de membrana para meio RPMI completo fresco e incubar para 35 °C em uma atmosfera de CO2 de 5% por 24 h.
- Dia 1 (estabelecimento de hNECs + CO-cultura PBMCs)
- Semente o número necessário de PBMCs em 150 μL (para 24-well)/300 μL (para 12-bem) de meio RPMI completo adicionando diretamente a suspensão PBMC na câmara basal de cada poço de hNECs não infectados ou infectados a partir do dia 0 (1,5 × 106 para placas de 24 poços e 3 × 106 para placas de 12 poços). Incubar a 37 °C por 24/48 h.
NOTA: O volume final na câmara basal após a criação da cocultura é de 500 μL (para 24-well)/1000 μL (para 12-well).
- Semente o número necessário de PBMCs em 150 μL (para 24-well)/300 μL (para 12-bem) de meio RPMI completo adicionando diretamente a suspensão PBMC na câmara basal de cada poço de hNECs não infectados ou infectados a partir do dia 0 (1,5 × 106 para placas de 24 poços e 3 × 106 para placas de 12 poços). Incubar a 37 °C por 24/48 h.
- Dias 2-3 (colheita de PBMCs 48/72 h infecção pós-viral)
- Coleta de supernantes apical (infecção pós-viral de 48/72 h)
- Adicione 50 μL (para 24-bem)/150 μL (para 12-bem) de 1x dPBS em cada câmara apical, e incubar a 37 °C por 10 min. Colete o 1x dPBS em tubos de 1,5 mL. Aliquot 25 μL (para 24-well)/50 μL (para 12-well) do supernasal para ensaio de placa em um novo tubo de 1,5 mL, e congele imediatamente tanto o estoque quanto as alíquotas a -80 °C.
- Coleta de RNA celular de hNECs (infecção pós-viral de 48/72 h)
- Transfira a inserção da membrana para um poço limpo, adicione 300 μL (para 24-bem)/600 μL (para 12-bem) de tampão de RNA para a câmara apical e incubar na rtp por 5 min. Colete o supernante em um tubo de centrífuga de 1,5 mL e armazene-o a -80 °C até a extração de RNA para análise molecular.
- Colheita de PBMCs (infecção pós-viral de 48/72 h)
- Com a base ampla de uma ponta de pipeta estéril, raspe suavemente a superfície do poço para desalojar os PBMCs ativados que podem ser aderentes à superfície do poço. Colete o meio basal contendo PBMCs em um tubo de centrífuga de 2 mL.
- Lave os poços 2x com 300 μL de 1x dPBS, e colete a lavagem no mesmo tubo de 2 mL. Centrifugar o tubo de 2 mL (500 × g, 5 min, rtp), e coletar o supernatante em um tubo fresco de 2 mL sem perturbar a pelota celular. Armazene o supernatante a -80 °C para análise de citocina e quimioterapia; resuspensar a pelota de célula em 200 μL de 1x dPBS.
- Coleta de supernantes apical (infecção pós-viral de 48/72 h)
6. Citometria de fluxo
NOTA: Esta seção do protocolo é continuada diretamente da seção anterior usando a suspensão da célula PBMC da etapa 5.3.3.2. Certifique-se de exposição mínima à luz durante as seguintes etapas nesta seção. Um painel de amostra de marcadores de coloração de superfície pode ser encontrado na Tabela 2.
- Coloração de superfície
- Transfira a cápsula de célula PBMC resuspended para uma placa de fundo de 96 V. Centrifugar lysate a 800 × g por 3 min, e remover o sobrenante.
- Incubar todos os PBMCs (exceto os "não manchados") com 100 μL de uma mancha de viabilidade por 15 min no rtp. Cubra até 200 μL com 150 μL de buffer MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting, classificação celular ativada magnética). Centrifugar lysate a 800 × g por 3 min, e descartar o sobrenante.
- Prepare um painel de anticorpos de coloração superficial de interesse com razões de diluição apropriadas e um volume final de 50 μL por reação (retoco com tampão MACS para obter o volume final). Realize a coloração da superfície adicionando 50 μL da mistura de anticorpos preparados às células usando uma pipeta multicanal. Incubar a 4 °C por 15 min no escuro.
- Lave adicionando 150 μL de buffer MACS. Centrifugar lysate a 800 × g por 3 min, e descartar o supernasce. Se não for necessária a coloração intracelular, proceda diretamente à incubação de 15 min na etapa 6.3.
- Coloração intracelular (se necessário)
- Adicione 100 μL de uma solução de fixação e permeabilização a cada poço. Incubar a 4 °C por 20 min no escuro. Cubra os poços com 100 μL de 1x tampão MACS.
- Centrífuga (800 × g, 3 min, 25 °C), e remova o sobrenante. Repita a lavagem adicionando 200 μL de 1x tampão de lavagem de permeabilização. Centrífuga (500 × g, 3 min, 25 °C), e remova o sobrenatante.
- Prepare as diluições para o painel de anticorpos de interesse para obter um volume final de 50 μL usando 1x tampão de lavagem de permeabilização. Incubar no gelo por 30 minutos no escuro. Adicione 200 μL de 1x tampão de lavagem de permeabilização.
- Centrifugar as células (800 × g, 3 min, 4 °C) e remover o sobrenante. Resuspenque as células em 100 μL de tampão de classificação celular ativado pela fluorescência.
- Pipette 200 μL de uma solução de lise em cada poço. Incubar por 15 min na RTP. Centrifugar lysate a 800 × g por 3 min e descartar o sobrenante.
- Resuspense as pelotas de célula em 200 μL de buffer MACS. Realize a citometria de fluxo de acordo com as configurações descritas anteriormente13, ou armazene a 4 °C no escuro.
7. Determinação dos níveis de citocina e quimiocina
- Processe 25 μL do supernasciente da câmara basal usando um ensaio multiplex de imunologia de acordo com o protocolo18 do fabricante.
- Calcule a concentração de cada analito usando o software multiplex manager utilizando um algoritmo de ajuste de curva (5 parâmetros) para a curva padrão.
8. Avaliação da contaminação viral
- Extrair RNA viral utilizando um kit de extração em 4 conjuntos de soluções: a solução de estoque H3N2, a diluição MOI 0.1 para infecção, as diluições seriais de 10x do MOI 0.1 e o meio basal das amostras (48 e 72 h pós-infecção viral)12.
- Selecione gene não estrutural (NS1) e matriz (M1) como alvos para reação em cadeia de polimerase (PCR) (ver a Tabela de Materiais para primers usados no experimento representativo).
- Realize a transcrição reversa-PCR (RT-PCR) (42 °C, 60 min) para converter o RNA viral em cDNA antes de realizar pcr quantitativo (qPCR) para medir os níveis NS1 e M1 como um proxy para presença viral, e correlacionar os níveis à curva padrão obtida da RT-qPCR realizada na diluição serial de 10x do MOI 0.1 alit. Consulte a Tabela 3 para a composição das misturas de reação e utilize as seguintes condições: pré-insubtação a 95 °C por 10 min, seguida de amplificação de 3 etapas para 40 ciclos: 95 °C para 10 s, 60 °C para 10 s, 72 °C para 30 s; curva de fusão: 95 °C para 10 s, 65°C para 60 s e 97°C para 1 s.
9. Ensaio de placa
- Dia 0: semeadura MDCK (Madin Darby Canine Kidney) em placas de 24 poços
- Remova o meio de um frasco T75 de células MDCK confluentes. Lave 2x com 1x PBS para remover todos os traços de soro. Trypsinize as células MDCK adicionando 10 mL de trippsina e incubando a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 20-30 min até que as células se desprendem.
NOTA: Não toque no frasco, pois isso pode resultar em aglomeração. - Pipete a suspensão da célula em um tubo de 15 mL contendo 2 mL de Meio Essencial Mínimo (EMEM) completo da Eagle. Centrífuga (300 × g, 5 min, rtp), e remova o supernante.
- Resuspende as células em 6 mL de EMEM completo. Conte as células por manchas azuis.
- Diluir a suspensão da célula MDCK a uma concentração de 1 × 105 células/mL, e sementes 1 mL da suspensão diluída em cada poço de uma placa estéril de 24 poços. Incubar a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5% por 24 horas para obter uma monocamada confluente de células MDCK em cada poço.
- Remova o meio de um frasco T75 de células MDCK confluentes. Lave 2x com 1x PBS para remover todos os traços de soro. Trypsinize as células MDCK adicionando 10 mL de trippsina e incubando a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 20-30 min até que as células se desprendem.
- Dia 1: infecção de células MDCK
- Prepare o meio de infecção. Retire o meio da monocamhada MDCK na placa de 24 poços e lave 2x com 1x dPBS. Para a segunda lavagem, deixe o PBS nos poços enquanto prepara diluições seriais do vírus.
- Descongele as amostras do vírus no gelo, e dilui-as em série em uma placa de 24 poços para obter diluições seriais de 10-1 a 10-6.
NOTA: Como exemplo, encha cada poço em uma placa de 24 poços com 270 μL de meio de infecção. - Adicione 30 μL da amostra do vírus ao primeiro poço da linha. Com uma nova ponta de pipeta, misture bem e transfira para o próximo poço na linha para diluir a amostra em 10x. A continuação até 10-6 diluição foi alcançada; realizar etapas 9.2.1-9.2.3 para todas as amostras de vírus.
- Remova o PBS da placa MDCK e infecte em duplicata com 100 μL das diluições virais preparadas. Para poços de controle, adicione 100 μL do meio de infecção (sem a amostra viral). Incubar a 35 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 por 1h, agitando a placa para eliminar manchas secas a cada 15 minutos.
- Remova o inóculo viral e adicione 1 mL de sobreposição líquida para cada poço. Incubar a 35 °C em uma atmosfera de CO2 de 5% por 72 h.
- Dia 4 (72 h pós-infecção): visualização de placa
- Remova a sobreposição líquida e fixe as células com 4% de formaldeído em 1x PBS por 1h. Remova a solução de formaldeído e lave uma vez com 1x PBS ou água destilada.
- Manche as células fixas adicionando 1% de solução violeta cristalina por 15 minutos. Remova o corante violeta cristalino e lave as células com água corrente. Seque a placa na rtp.
- Uma vez seco, conte placas e calcule o título viral de acordo com a seguinte fórmula:
Número de placas × Fator de Diluição = Número de Placa - Unidades de Formação em 100 μL
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Representative Results
Embora as células T convencionais formem o principal repertório de resposta imune adaptativa contra infecção viral para facilitar o despejo viral, a população de células T inatas trabalha em um espectro mais amplo para suprimir a carga viral para liberação eficaz em um estágio posterior. Portanto, este protocolo cria especificamente uma condição robusta para estudar células T inatas, sua ativação e sua população funcional após a infecção por gripe, sem precisar de amostras epiteliais e células imunes do mesmo doador. Este protocolo também pode ser aplicado a outros vírus, embora possa ser limitado a vírus com liberação apical, ou seja, nenhum vírus deve entrar na camada basal para entrar em contato com o compartimento PBMC.
Com base nos resultados representativos da Figura 1, este protocolo pode ajudar a obter populações de hNESPC cultivadas a partir de uma suspensão celular primária em uma camada alimentadora 3T3. A Figura 1 fornece uma amostra da progressão esperada dos hNESPCs à medida que crescem na camada alimentador 3T3. Essas células serão utilizadas para diferenciação na cultura ALI para obter hNECs multicamadas, completas com células ciliadas e cálices funcionais (Figura 4). Usando os hNECs, a ativação inata de células T pode ser investigada usando citometria de fluxo. Os resultados mostrados na Figura 5 mostram a detecção de populações de células MAIT, células γδ-T e células NK, que foram significativamente aumentadas na cocultura envolvendo hNECs infectados com vírus da gripe. Essa configuração pode então ser aplicada a outras cepas do vírus da gripe para provocar a população universal entre as cepas, bem como outros vírus e sua capacidade de ativar populações de células T inatas. Além disso, o painel de detecção também pode ser personalizado de acordo com a população de células imunes inatas de interesse para observar sua respectiva ativação em condições de co-cultura com células epiteliais infectadas.
Figura 1: hNESPCs cultivados em uma camada alimentador 3T3 2/5/10 dias a partir da semeadura. Dia 2: Observe as ilhotas dos hNESPCs (um exemplo é demarcado com uma seta branca) que devem ser observadas 2 dias após a semeadura na camada alimentador 3T3. Dia 5: As ilhotas observadas no dia 2 devem agora ser maiores (exemplos de ilhas de hNESPCs são demarcadas por círculos verdes), e a camada 3T3 deve ser observada como degeneração. Dia 10: Os hNECPSs devem dominar toda a placa com pouca ou nenhuma célula 3T3 visível. Barras de escala para o dia 2 e dia 5 = 50 μm com base em uma ampliação de 200x, barra de escala para o dia 10 = 100 μm com base em uma ampliação de 100x. Abreviação: hNESPCs = células-tronco/progenitoras nasais humanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diagramas de poços para pastilhas de membrana em placas de 24 poços e 12 poços. Observe o volume médio a ser utilizado para cada compartimento. hNESPCs são semeados nas câmaras apical das pastilhas de membrana. Abreviação: hNESPCs = células-tronco/progenitoras nasais humanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Diagramas de poço para pastilhas de membrana em placas de 24 poços e 12 poços para o estabelecimento da cocultura ALI. Observe o volume médio a ser utilizado para cada compartimento. Observe as diferenças no volume médio a serem utilizados para os diferentes intervalos (2 dias/3 dias) entre as alterações médias. Abreviação: ALI = interface ar-líquido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: β4-Tubulin e MUC5AC co-mancha de uma camada hNEC. β4-Tubulin está manchado em verde, enquanto MUC5AC está manchado em vermelho. Os núcleos estão manchados em azul com DAPI. MUC5AC indica a presença de células de cálice produtoras de muco, enquanto β4-tubulina indica a presença de cília em células ciliadas. Barra de escala = 20 μm com base na ampliação de 600x. Abreviaturas: hNEC = célula epitelial nasal humana; MUC5AC = mucina 5AC; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados representativos de PBMCs incubados com ou sem epitélio nasal ou epitélio infectado pela gripe por 24 h. A ativação de células MAIT, Vδ1 T, células Vδ2 T e células NK foi determinada por marcadores específicos do tipo celular, incluindo Vα 7.2 TCR, Vδ1 TCR, Vδ2 TCR, CD56 e CD69. Os valores acima dos portões indicam a porcentagem de células CD69 positivas. Abreviaturas: PBMCs = células mononucleares de sangue periféricos; Epith = epitélio nasal; FLU-Epith = epitélio infectado pela gripe; MAIT = células T invariantes associadas à mucosa; NK = assassino natural; TCR = receptor de células T; CD = cluster de diferenciação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Média | Receita | Composição | Comentários |
| Meio 3 | Mistura DMEM/Nutrientes F-12 | 500 mL | |
| Fator de Crescimento Epitelial Humano | 5 ng/mL | ||
| Insulina | 2,5 μg/mL | ||
| Toxina da cólera | 0.1 nM | ||
| Hidrocortisona | 0,5 μg/mL | ||
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | 2 nM | ||
| Suplemento N-2 | 5 mL | 10 μL/mL | |
| Antibiótico-antimíctico | 5 mL | ||
| Mídia de diferenciação | PneumaCult-ALI Meio Basal | 441 mL | |
| Suplemento PneumaCult-ALI 10x | 50 mL | ||
| Solução de hidrocortisona (200x) | 2,5 mL | ||
| 0,2% (2 mg/mL; 1000 UI/mL) Sal de sódio de heparina em salina tamponada com fosfato | 1 mL | ||
| Antibiótico-antimíctico (100x) | 5 mL | ||
| Suplemento de manutenção PneumaCult-ALI (100x) | 500 μL | Apenas para ser adicionado antes do uso | |
| Meio Essencial Mínimo (DMEM) completo de Dulbecco | DMEM/Alta glicose | 450 mL | |
| Soro bovino fetal inativado pelo calor | 50 mL | ||
| Antibiótico-antimíctico (100x) | 5 mL | ||
| Meio completo do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | RPMI 1640 (w L-Glutamina) | 445 mL | |
| Soro bovino fetal inativado pelo calor | 50 mL | ||
| Antibiótico-antimíctico (100x) | 5 mL | ||
| Emem (Complete Eagle's Minimal Essential Medium, meio essencial mínimo da águia) | EMEM (w L-Glutamina) | 450 mL | |
| Soro bovino fetal inativado pelo calor | 50 mL | ||
| Meio de Infecção | EMEM (w L-Glutamina) | 4 mL | |
| Trippsina TPCK (500 μg/mL) | 8 μL | Concentração final de tripca de tripca TPCK de 1 μg/mL | |
| Tampão de classificação celular ativado por magnético | 1x PBS | 498 mL | |
| 0,5 M EDTA | 2 mL | ||
| BSA (Grau de Cultura tecidual) | 2,5 g | ||
| DMEM completo com suplemento de mitomicina C | DMEM completo | 10 mL | |
| Mitomicina C | 500 μL | Mitomicina C (10 μg/mL) |
Tabela 1: Receita para mídias utilizadas.
| Marcador de superfície celular | Fluoróforo |
| Receptor de células T Vδ1 (TCR) | Isothiocnato de fluoresceína (FITC) |
| Vδ2 TCR | Peridinin-cholorphyll-protein (PerCP) |
| CD3 | V500 |
| CD8 | Corante de aofilia-ciane-ciane 7 (APC-Cy7) |
| CD14 | Ficoerythrin (PE)-CF594 |
| CD56 | Ficoerthrina (PE)-Cianeina 7 (Cy7) |
| CD69 | Violeta Brilhante 421 (BV421) |
| CD83 | Aophycocyanina (APC) |
| CD161 | Violeta Brilhante 605 (BV605) |
| Vα 7.2 | Ficoerythrin (PE) |
| CD38 | Brilhante UltraViolet 395 (BUV395) |
Tabela 2: Marcadores de coloração da superfície da amostra.
| qPCR Reaction Mix | qPCR Master Mix | 5 μL |
| Água sem nuclease | 3 μL | |
| Primer avançado (1 mM) | 0,5 μL | |
| Primer reverso (1 mM) | 0,5 μL | |
| cDNA (12,5 ng/μL) | 1 μL | |
| Volume total de reação | 10 μL | |
| Mistura de reação RT-PCR | RT-PCR 5x Buffer | 2,5 μL |
| Primers aleatórios (500 ng/μL) | 0,2 μL | |
| Inibidor de RNase | 0,625 μL | |
| dNTP Mix | 2,5 μL | |
| Transcriptase reversa | 0,5 μL | |
| RNA (200 ng/μL) | 1 μL | |
| Água sem nuclease | 12.675 μL | |
| Volume total de reação | 20 μL |
Tabela 3: Receita para misturas de reação de reação de corrente de polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) e PCR quantitativo (qPCR).
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Discussion
As respostas imunológicas inatas contra vírus são um campo de estudo pouco investigado no manejo antiviral. As células epiteliais das vias aéreas e as células imunes inatas trabalham em conjunto para suprimir a replicação viral durante uma infecção, além de servir como determinante de resposta adaptativa hiperativa se a carga viral não for mantida em xeque 12,13,17. No entanto, o desenvolvimento de um modelo humano relevante para o estudo do crosstalk imunológico inato epitelial para investigar a ativação de células imunes inatas para conferir uma resposta antiviral apropriada continua sendo um desafio. Assim, este modelo de cocultura ALI representa uma técnica versátil que pode ser usada para avaliar uma série de interações entre a camada epitelial nasal e as células imunes. Como este modelo combina hNECs in vitro diferenciados, análise de ativação do PBMC via citometria de fluxo e infecção viral, muitas das etapas cruciais foram claramente demarcadas para garantir o sucesso deste protocolo. Além disso, novas modificações também podem ser feitas na parte das vias aéreas envolvidas onde podem ser utilizadas células in vitro diferenciadas das vias aéreas superior e inferior, adicionando outra camada de versatilidade ao protocolo.
No entanto, ao trabalhar com o crosstalk de células epiteliais-imunes em infecção viral, é fundamental que os vírus não interajam diretamente com os PBMCs para identificar fatores solúveis locais precoces derivados da epitelial liberados pelos hNECs. Portanto, este modelo é mais adequado para examinar vírus com liberação viral polarizada, em que os vírus só saem da superfície apical para a câmara apical, por exemplo, os vírus da gripe12 e o vírus SARS-CoV-219. Além disso, para evitar o vazamento de vírus de liberação apical na câmara basal comprometendo o experimento, uma camada epitelial intacta de espessura suficiente é vital. Portanto, é importante que a medição do TEER e a quantificação viral do RNA sejam realizadas para garantir que os resultados estejam livres de vazamentos virais na câmara basal 13,16,20. Uma leitura teer de >1000 implica uma multicamada intacta de células adequadas para vírus com liberação polarizada; a mídia basal deve estar livre de qualquer contaminação viral de RNA 13,15,16. No entanto, a utilidade do modelo para vírus de liberação bidirecional, como rinovírus, continua a ser explorada16. Tais vírus não se limitam a liberar sua descendência de forma polarizada e podem liberar bidirecionalmente novos vírus em regiões apical e basal do epitélio. Mais otimização é necessária antes que este modelo possa ser aplicado a vírus com liberação não polarizada.
Como este protocolo envolve trabalhar com amostras humanas de indivíduos diferentes, nenhuma amostra de hNECs exibirá as mesmas propriedades e respostas12,16. Por exemplo, a viscosidade do muco produzido pela camada hNEC terminantemente diferenciada pode diferir muito. A velocidade do desenvolvimento de cílios também pode ser diferente. É importante, portanto, exercer algum nível de flexibilidade ao aderir às diretrizes estabelecidas neste protocolo. Embora seja certamente possível utilizar linhas celulares epiteliais, isso removeria a complexidade (muco, interações entre diferentes tipos de células) das interações entre os diferentes tipos celulares da camada epitelial, o que seria ideal para a investigação de como o crosstalk epitelial influencia as respostas dos PBMCs. Uma linha celular primária é necessária para imitar a fisiologia dos tecidos nasais, onde as células são multicamadas, e os diferentes tipos de células são localizados para seu próprio nicho individual, embora a variabilidade possa ser um problema. A variabilidade nesse sentido pode ser superada utilizando o sequenciamento de RNA unicelular para diferenciar e separar a população heterogênea das células.
Os tipos de interações que podem ser avaliadas são de fato limitados pela origem dos PBMCs e dos hNECs. Quando os PBMCs e os HNECs são obtidos de diferentes doadores, garantir a integridade epitelial e a separação é crucial. Quando os PBMCs entram em contato com os HNECs, podem ocorrer reações imunes aogênicas. Assim, as únicas interações relevantes são as interações mediadas por fatores solúveis que podem passar pelas pastilhas de membrana, como foi descrito no protocolo acima. No entanto, quando ambas as populações de células se originam do mesmo indivíduo, este modelo tem uma camada adicional de utilidade, pois as reações convencionais de células imunes entre os HNECs e a população de PBMC podem agora ser avaliadas, incluindo citotoxicidade mediada por células T e respostas mediadas por anticorpos. Além disso, estudos epigenéticos também podem ser realizados para examinar como modificações no genoma podem afetar a citocina gene/expressão/secreção de proteínas.
Além disso, diferentes populações celulares podem ser adicionadas à câmara basal para investigar uma população específica. Isso pode ser realizado isolando as populações celulares de interesse (células T, células NK, monócitos) e introduzindo-as na câmara basal em vez dos PBMCs. No entanto, esse modelo não pode ser usado para investigar interações celulares que requerem contato direto devido à separação das duas populações celulares pela membrana. Como tal, a investigação de respostas imunes adaptativas pode ser limitada por esse detalhe. Em conclusão, este modelo de co-cultura ALI oferece um ponto de partida versátil para a investigação in vitro do crosstalk entre tecidos nasais e células imunes. O protocolo descrito neste manuscrito tenta fornecer uma diretriz que será útil mesmo que as populações/condições sejam alteradas.
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Disclosures
Todos os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer à equipe de pesquisa do Departamento de Otorquinologia e Departamento de Microbiologia e Imunologia da NUS por sua ajuda com o trabalho relacionado à cultura e à cultura viral do HNEC. Gostaríamos também de agradecer aos cirurgiões e equipe cirúrgica do Hospital Universitário Nacional, Departamento de Otormologia, por sua ajuda no fornecimento das amostras de células e sangue necessárias para o estudo.
Este estudo foi financiado pelo National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (para De Yun Wang) e MOH-OFYIRG19may-0007 (para Kai Sen Tan). Kai Sen Tan é um beneficiário do apoio de bolsas da European Allergy and Clinical Imunology (EAACI) Research Fellowship 2019.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 |
References
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