该分级分离方案将使研究人员能够从哺乳动物细胞中分离细胞质、核、线粒体和膜蛋白。后两个亚细胞级分通过等密度梯度进一步纯化。
该协议描述了使用洗涤剂,机械裂解和等密度梯度离心的组合从哺乳动物细胞中获得亚细胞蛋白级分的方法。该程序的主要优点是它不依赖于仅使用增溶去垢剂来获得亚细胞级分。这使得可以将质膜与细胞的其他膜结合细胞器分离。该程序将有助于使用可重复,可扩展和选择性的方法确定细胞中的蛋白质定位。该方法已成功用于从人单核细胞系U937中分离胞质蛋白、核蛋白、线粒体蛋白和质膜蛋白。尽管针对该细胞系进行了优化,但该过程可以作为其他细胞系亚细胞分离的合适起点。讨论了该程序的潜在陷阱以及如何避免它们,以及可能需要考虑其他细胞系的改变。
亚细胞分级分离是通过多种方法裂解细胞并将其分离成其组成成分的过程。研究人员可以使用这种技术来确定哺乳动物细胞中的蛋白质定位或富集否则无法检测到的低丰度蛋白质。虽然目前存在亚细胞分离的方法,也可以购买商业试剂盒,但它们受到该程序试图克服的几个限制。大多数细胞分级分离方法完全基于洗涤剂1,2,依赖于使用含有越来越多的去垢剂的缓冲液来溶解不同的细胞成分。虽然这种方法快速方便,但它会导致不纯的馏分。这些旨在使研究人员能够轻松分离细胞的一种或两种成分,但还不够复杂,无法同时从样品中分离出多个亚细胞组分。仅依靠洗涤剂通常会导致膜封闭的细胞器和质膜被不加选择地溶解,从而使这些成分的分离变得困难。使用这些试剂盒的另一个复杂因素是研究人员无法针对特定应用对其进行更改/优化,因为大多数组件都是专有配方。最后,这些试剂盒可能非常昂贵,使用次数有限,因此对于较大样品来说不太理想。
尽管有不依赖去垢剂的线粒体分离试剂盒,但它们并非设计用于分离质膜,并且产生的样品量明显低于标准分离方案3,4。虽然差速离心方法更耗时,但它们通常会产生不同的馏分,而仅使用基于洗涤剂的试剂盒无法获得1。无需单独使用增溶去垢剂的分离还允许使用超速离心和等密度梯度进一步纯化,从而减少交叉污染。该分级分离方案展示了使用基于去垢剂和高速离心的方法的组合从U937单核细胞中分离亚细胞级分。该方法将有助于分离哺乳动物细胞的核、细胞质、线粒体和质膜成分,而馏分之间的污染最小。
该方法是先前发表的亚细胞分级分离方法的修改版本,无需使用高速离心11。这种改进的方法需要更专业的设备才能获得最佳结果,但更全面且可重复性一致。
由于无法分离线粒体和膜样品以分析坏死性凋亡期间的蛋白质定位,因此有必要开发初始方案12。尝试使用大多数市售试剂盒中发现的完全基于洗涤剂的方法,导致含有质膜和细胞中?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了NIH R15-HL135675-01和NIH 2 R15-HL135675-02对T.J.L的支持。
Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | 61-BB50-DX | |
digitonin | Sigma | D141 | |
end-over-end rotator | ThermoFisher | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E9884 | |
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | |
GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | |
HEPES | VWR | 97064-360 | |
Hexylene glycol | Sigma | 68340 | |
Igepal | Sigma | I7771 | Non-ionic, non-denaturing detergent |
KCl | Sigma | P9333 | |
Mannitol | Sigma | M9647 | |
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
NaCl | Sigma | S9888 | |
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | |
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium | Sigma | D1556-250ML | |
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | |
refrigerated centrifuge | ThermoFisher | ||
S50-ST Swinging Bucket Rotor | Eppendorf | ||
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | 436143 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
sodium orthovanadate (SOV) | Sigma | 567540 | |
sonicator | ThermoFisher | ||
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher | ||
Stainless Steel Beads 3.2 mm | Next Advance | SSB32 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 97062-370 | |
Tween 20 | non-ionic detergent in western blotting buffers | ||
VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 |