ROS Imagerie des cellules vivantes au cours du développement neuronal

Summary

Ce protocole décrit l’utilisation d’un peroxyde d’hydrogène génétiquement codé (H2O2)-biocapteur dans les neurones et les larves de poisson zèbre cultivés pour évaluer les rôles physiologiques de signalisation de_H2O2pendant le développement du système nerveux. Il peut être appliqué à différents types de cellules et modifié avec des traitements expérimentaux pour étudier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans le développement général.

Abstract

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des molécules de signalisation bien établies, qui sont importantes dans le développement normal, l’homéostasie, et la physiologie. Parmi les différents ROS,le peroxyde d’hydrogène (H2O2) est le mieux caractérisé en ce qui concerne les rôles dans la signalisation cellulaire. _{H2O2 a} été impliqué lors du développement chez plusieurs espèces. Par exemple, une augmentation transitoire de_H2O2 a été détectée chez les embryons de poissons zèbres au cours des premiers jours suivant la fécondation. En outre, l’épuisement d’une source cellulaire importante H_2O2, NADPH oxydase (NOX), altère le développement du système nerveux tel que la différenciation, la croissance axonale, et le guidage des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGCs) in vivo et in vitro. Ici, nous décrivons une méthode d’imagerie des niveaux intracellulaires de_H2O2 dans les neurones de poissons zèbres cultivés et les larves entières pendant le développement en utilisant le biocapteur génétiquement codé_{H2 O2}spécifique, roGFP2-Orp1. Cette sonde peut être exprimée de manière transitoire ou stable chez les larves de poissons zèbres. En outre, la lecture ratiométrique diminue la probabilité de détecter des artefacts en raison de l’expression génique différentielle ou des effets de volume. Tout d’abord, nous démontrons comment isoler et mettre en culture des GRC dérivés d’embryons de poissons zèbres qui expriment transitoirement roGFP2-Orp1. Ensuite, nous utilisons des larves entières pour surveiller les niveaux_{de H2O2}au niveau des tissus. Le capteur a été validé par l’ajout de_H2O2. De plus, cette méthodologie pourrait être utilisée pour mesurer les niveaux_{de H2O2}dans des types de cellules et des tissus spécifiques en générant des animaux transgéniques avec une expression de biocapteur spécifique aux tissus. Comme les poissons zèbres facilitent les manipulations génétiques et développementales, l’approche démontrée ici pourrait servir de pipeline pour tester le rôle de_H2O2 au cours du développement neuronal et embryonnaire général chez les vertébrés.

Introduction

La signalisation réactive des espèces de l’oxygène (ROS) régule le développement et le fonctionnement du système nerveux¹. Une source importante de ROS cellulaires sont les oxydases NADPH (NOX), quisont des protéines transmembranaires générant du superoxyde et du peroxyde d’hydrogène (H2O2)2. Les enzymes NOX se trouvent dans tout le système nerveux central (SNC), et les ROS dérivés du NOX contribuent au développement neuronal^3,4,5,6. Il a été démontré que le maintien et la différenciation des cellules souches neurales, l’établissement de la polarité neuronale, l’excroissance des neurites et la plasticité synaptique nécessitent des niveaux adéquats de ROS^7,8,9,10,11. D’autre part, la production incontrôlée de ROS par les NEX contribue aux troubles neurodégénératifs, y compris la maladie d’Alzheimer, la sclérose en plaques et les lésions cérébrales traumatiques^12,13,14. Par conséquent, la production de ROS physiologiquement pertinents est essentielle au maintien de conditions saines.

La mise au point de biocapteurs génétiquement codés a grandement facilité la détection des ROS cellulaires. Un avantage important des biocapteurs génétiquement codés est l’augmentation de la résolution temporelle et spatiale du signal ROS, car ces capteurs peuvent être spécifiquement ciblés à des endroits distincts. Le GFP sensible aux redox (roGFP) est l’un des types de ces biocapteurs ROS. La variante roGFP2-Orp1 détecte spécifiquement _H2O2à travers son domaine Orp1, qui est une protéine de la famille des glutathion peroxiredoxin de levure^15,16. L’oxydation de la protéine Orp1 est transférée dans roGFP2 pour modifier sa conformation(figure 1A). La sonde présente deux pics d’excitation proches de 405 nm et 480 nm, et un seul pic d’émission à 515 nm. Lors de l’oxydation, l’intensité de fluorescence autour des pics d’excitation change: alors que l’excitation de 405 nm augmente, l’excitation de 480 nm diminue. Ainsi, roGFP2-Orp1 est un biocapteur ratiométrique,et les niveaux_H2O2sont détectés par le rapport des intensités de fluorescence excitées à deux longueurs d’onde différentes(figure 1B). Dans l’ensemble, roGFP2-Orp1 est un outil polyvalent pour l’imagerie ROS qui peut être utilisé efficacement in vivo.

Figure 1: Spectres schématiques de représentation et d’excitation de roGFP2-Orp1. (A) Le transfert d’oxydant se produit entre Orp1 et roGFP2 en réponse à_H2O2,conduisant à des changements conformationnels dans roGFP2. (B) Les spectres d’excitation du roGFP2-Orp1 présentent deux pics d’excitation à 405 nm et 480 nm et un pic d’émission unique à 515 nm. Lors de l’oxydation par_H2O2,l’excitation de 405 nm augmente tandis que l’excitation de 480 nm diminue. Il en résulte une lecture ratiométrique pour la présence_H2O2. Le chiffre a été modifié à partir de Bilan et Belousov (2017)¹⁶ et Morgan et coll. (2011)²⁵. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Le système modèle Danio rerio (poisson zèbre) présente plusieurs avantages pour l’application de biocapteurs génétiquement codés. La transparence optique des embryons et des larves permet une imagerie in vivo non invasive. De nouveaux outils d’imagerie sont en cours de développement pour atteindre une résolution plus élevée et une pénétration plus profonde¹⁷. En outre, il existe des outils établis pour la manipulation génétique (expression ectopique de l’ARNm, transgénèse Tol2, etc.) et l’édition du génome (TALENs, CRISPR/Cas9, etc.), qui favorisent la génération d’animaux transgéniques^18. Au fur et à mesure que les embryons de poisson zèbre se développent à l’extérieur de la mère, ce système facilite l’accès et la manipulation des embryons. Par exemple, les injections au stade unicellulaire et les traitements médicamenteux peuvent facilement être effectués.

Ici, nous avons utilisé le poissonzèbre pour exprimer transitoirement le biocapteur roGFP2-Orp1 spécifique à_H2O2en injectant de l’ARNm transcrit in vitro. Ces embryons peuvent être utilisés à la fois pour l’imagerie in vitro de neurones cultivés et pour l’imagerie in vivo (figure 2). Nous décrivons un protocole pour disséquer et plaquer les cellules rétiniennes de ganglion (RGCs) des embryons de poisson zèbre suivis d’évaluer H₂O₂– niveaux dans les neurones cultivés. Ensuite, nous présentons une méthode d’imagerie in vivo d’embryons et de larves exprimant roGFP2-Orp1 à l’aide de la microscopie confocale. Cette approche permet non seulement de déterminer les niveaux physiologiques de_H2O2-mais aussi les changements potentiels survenant à différents stades ou conditions de développement. Dans l’ensemble, ce système fournit une méthode fiable pour détecter_H2O2dans les cellules vivantes et les animaux pour étudier le rôle de H₂O₂ dans le développement, la santé et la maladie.

Figure 2. Aperçu de l’approche expérimentale. En bref, après le prélèvement d’embryons, l’ARNm roGFP2-Orp1 est injecté dans le jaune d’embryons de poisson zèbre au stade cellulaire. Les embryons en développement peuvent être utilisés à la fois pour l’imagerie in vitro (A)et(B) in vivo. (A) Les embryons GFP-positifs sont utilisés pour disséquer des rétines pour la collecte de RGC à 34 hpf. Les RGCs dissociés sont plaqués sur des lamaux de couverture enduits de PDL/laminine dans des milieux ZFCM (+). L’imagerie du cône de croissance peut être effectuée car les RGCs étendent leurs axones après 6-24 h de placage. Les cellules peuvent être soumises à différents traitements pour mesurer les changements potentiels des niveaux de_H2O2. Ici, nous avons mesuréles niveaux de_H2O2dans les cônes de croissance des RGCs (rouge). (B) les embryons positifs à la GFP sont utilisés pour l’imagerie in vivo. À l’âge souhaité, les embryons peuvent être anesthésiés et montés sur des plats à fond de verre de 35 mm pour l’imagerie confocale. Ici, les embryons sont montés ventralement pour l’imagerie rétinienne. Le schéma montre le développement rétinien chez le poisson zèbre. Les RGCs forment la couche cellulaire ganglionnaire (GCL), qui est la couche la plus interne de la rétine. Les axones de RGC se développent en nerf optique pour croiser le midline, formant le chiasm optique. Ensuite, les axones RGC se développent dorsalement pour faire des synapses dans le tectum optique dans le mécérine. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été examinées et approuvées sur le plan éthique par le Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), conformément aux directives des NIH avec le protocole 2006002050 approuvé le 24/07/2020. 1. Préparation des solutions Support E2 (1x) Préparer des solutions 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) et 500x E2C (100 mL) en combinant tous les composants indiqués dans le tableau 1. Solutions Autoclave E2A, E2B et …

Representative Results

Les CRG de poissons zèbres d’élevage étendent les axones à l’intérieur de 1d. Une image représentative au rapport 405/480du biocapteurH2O2est représentée sur la figure 4A. Le corps cellulaire, axone, et les cônes de croissance sont clairement visibles dans les neurones individuels. Ces neurones peuvent être soumis à différents traitements au fil du temps pour surveiller les changementsH2O2. Nous avons précédemment constaté que l?…

Discussion

Il y a plusieurs étapes critiques qui nécessitent une attention particulière tout au long de ce protocole. Nous pensons que la prise en compte de ces points améliorera le flux expérimental. Pour la culture primaire de RGC, la stérilité du ZFCM(-) est très importante, car ce milieu de culture ne contient pas d’antibiotiques et la contamination peut survenir avant ou pendant l’imagerie. Pour l’éviter, nous vous conseillons de préparer et d’utiliser ZFCM(-) uniquement à l’intérieur d’une armoire de b…

Materials

35-mm culture dish	Sarstedt	83-3900
35-mm glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes	Sutter/Fisher Scientific	NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher Scientific	C79-500
Cover glass	Corning	2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)	VWR	25384-094
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	26140087
Glucose	Sigma Aldich	G7528
HEPES	Sigma Aldich	H4034
Injection Mold	Adaptive Science Tools	TU-1
Inverted Microscope	Nikon	TE2000
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss	710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red	Gibco/Fisher Scientific	11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
Low melting agarose	Promega	V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
PBS	Hyclone/Fisher Scientific	SH3025601
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Phenol Red	Sigma Aldich	P0290
Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldich	P7629
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	PV820
Poly-D-Lysine (PDL)	Sigma Aldich	P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
Recombinant mouse slit2	R&D Systems	5444-SL-050
Sodium Pyruvate	Sigma Aldich	P5280
Steritop 0.22 µm filter	Millipore	S2GPT05RE
TE Buffer	Ambion	AM9860
Tricaine Methanesulfonate	Sigma Aldich	E10521
Vertical Pipette Puller	David Kopf Instruments	700C