ROS Live Cell Imaging under nevronutvikling

Summary

Denne protokollen beskriver bruken av en genetisk kodet hydrogenperoksid (H2 O_2)-biosensori kultiverte sebrafisk-nevroner og larver for å vurdere de fysiologiske signalrollene til H₂O₂ under nervesystemutvikling. Det kan brukes på forskjellige celletyper og modifisert med eksperimentelle behandlinger for å studere reaktive oksygenarter (ROS) i generell utvikling.

Abstract

Reaktive oksygenarter (ROS) er veletablerte signalmolekyler, som er viktige i normal utvikling, homeostase og fysiologi. Blant de forskjellige ROS er hydrogenperoksid_(H2O₂) best karakterisert med hensyn til roller i cellulær signalering. H₂O₂ har vært involvert under utviklingen i flere arter. For eksempel har det blitt påvist en forbigående økning i H₂O₂ i sebrafiskembryoer i løpet av de første dagene etter befruktning. Videre, uttømming av en viktig cellulær H₂O_2-kilde, NADPH oxidase (NOX), svekker utviklingen av nervesystemet som differensiering, axonal vekst og veiledning av retinal ganglion celler (RGCs) både in vivo og in vitro. Her beskriver vi en metode for avbildning av intracellulære H₂O_2-nivåer i dyrkede sebrafisk-nevroner og hele larver under utvikling ved hjelp av den genetisk kodede H₂O₂-spesifikke biosensoren, roGFP2-Orp1. Denne sonden kan være forbigående eller stabilt uttrykt i sebrafisk larver. Videre reduserer den ratiometriske avlesningen sannsynligheten for å oppdage artefakter på grunn av differensialgenuttrykk eller volumeffekter. For det første demonstrerer vi hvordan man isolerer og kultur RGCer avledet fra sebrafisk embryoer som midlertidig uttrykker roGFP2-Orp1. Deretter bruker vi hele larver for å overvåke H₂O₂ nivåer på vevsnivå. Sensoren er validert ved å legge til H₂O₂. I tillegg kan denne metoden brukes til å måle H₂O_2-nivåer i bestemte celletyper og vev ved å generere transgene dyr med vevsspesifikk biosensoruttrykk. Ettersom sebrafisk letter genetiske og utviklingsmessige manipulasjoner, kan tilnærmingen som er demonstrert her tjene som en rørledning for å teste rollen som H₂O₂ under nevronal og generell embryonal utvikling i vertebrater.

Introduction

Reaktive oksygenarter (ROS) som signaliserer regulerer utvikling og funksjon av nervesystemet¹. En viktig cellulær ROS-kilde er NADPH oksidase (NOX), som er transmembrane proteiner som genererer superoksid og hydrogenperoksid_(H2O₂)². NOX enzymer finnes i hele sentralnervesystemet (CNS), og NOX-avledet ROS bidrar til nevronutvikling^3,4,5,6. Vedlikehold og differensiering av nevrale stamceller, etablering av nevronal polaritet, nevrittutvekst og synaptisk plastisitet har vist seg å kreve tilstrekkelige nivåer av ROS^7,8,9,10,11. På den annen side bidrar ukontrollert produksjon av ROS av NOXer til nevrodegenerative lidelser, inkludert Alzheimers sykdom, multippel sklerose og traumatisk hjerneskade^12,13,14. Derfor er produksjon av fysiologisk relevant ROS avgjørende for å opprettholde sunne forhold.

Utvikling av genetisk kodede biosensorer forenklet påvisning av cellulær ROS sterkt. En viktig fordel med genetisk kodede biosensorer er den økte tidsmessige og romlige oppløsningen til ROS-signalet, da disse sensorene kan målrettes spesifikt mot forskjellige steder. Redoksensitiv GFP (roGFP) er en type slike ROS biosensorer. RoGFP2-Orp1-varianten oppdager spesielt H₂O₂ gjennom Orp1-domenet, som er et glutathione peroxiredoxin-familieprotein fra gjær^15,16. Oksidasjonen av Orp1-proteinet overføres til roGFP2 for å endre konformasjonen (figur 1A). Sonden viser to eksitasjonstopper nær 405 nm og 480 nm, og en enkelt utslippstopp på 515 nm. Ved oksidasjon endres fluorescensintensiteten rundt eksitasjonstopper: mens 405 nm eksitasjon øker, reduseres 480 nm eksitasjon. Dermed er roGFP2-Orp1 en ratiometrisk biosensor, og H₂O₂-nivåer oppdages av forholdet mellom fluorescensintensiteter begeistret ved to forskjellige bølgelengder (Figur 1B). Totalt sett er roGFP2-Orp1 et allsidig verktøy for ROS-avbildning som kan brukes effektivt in vivo.

Figur 1: Skjematisk representasjon og eksitasjonsspektra av roGFP2-Orp1. (A) Oksidantoverføring skjer mellom Orp1 og roGFP2 som svar på H₂O₂, noe som fører til konformasjonsendringer i roGFP2. (B) Eksitasjonsspektraet til roGFP2-Orp1 viser to eksitasjonstopper på 405 nm og 480 nm og enkeltutslippstopp på 515 nm. Ved oksidasjon med H₂O₂øker eksitasjonen på 405 nm mens eksitasjonen på 480 nm minker. Dette resulterer i en ratiometric avlesning for H₂O₂ tilstedeværelse. Figuren er modifisert fra Bilan og Belousov (2017)¹⁶ og Morgan et al. (2011)²⁵. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Danio rerio (sebrafish) modellsystemet har flere fordeler for å bruke genetisk kodede biosensorer. Den optiske gjennomsiktigheten til embryoer og larver muliggjør ikke-invasiv in vivo-avbildning. Nye bildeverktøy utvikles for å oppnå høyere oppløsning og dypere penetrasjon¹⁷. Videre er det etablerte verktøy for genetisk manipulasjon (ektopisk mRNA-uttrykk, Tol2 transgenese, etc.) og genomredigering (TALENer, CRISPR / Cas9, etc.), som fremmer generering av transgene dyr¹⁸. Etter hvert som sebrafiskembryoene utvikler seg utenfor moren, gir dette systemet ytterligere enklere tilgang og manipulering av embryoene. For eksempel kan encellede injeksjoner og narkotikabehandlinger enkelt gjøres.

Her brukte vi sebrafisk for å midlertidig uttrykke H₂O₂-spesifikk biosensor roGFP2-Orp1 ved å injisere in vitro-transkribert mRNA. Disse embryoene kan brukes til både in vitro-avbildning av dyrkede nevroner og in vivo-avbildning (figur 2). Vi beskriver en protokoll for dissekering og plating retinal ganglion celler (RGCs) fra sebrafisk embryoer etterfulgt av å vurdere_H2O₂-nivåer i dyrkede nevroner. Deretter presenterer vi en metode for in vivo-avbildning av roGFP2-Orp1-uttrykkende embryoer og larver ved hjelp av konfokal mikroskopi. Denne tilnærmingen tillater ikke bare å bestemme fysiologiske H₂O_2-nivåer,men også potensielle endringer som skjer i forskjellige utviklingsstadier eller forhold. Totalt sett gir dette systemet en pålitelig metode for å oppdage H₂O₂ i levende celler og dyr for å studere rollen som H₂O₂ i utvikling, helse og sykdom.

Figur 2. Omriss av den eksperimentelle tilnærmingen. Kort sagt, etter embryosamling injiseres roGFP2-Orp1 mRNA i eggeplommen av encellede sebrafiskembryoer. Utvikling av embryoer kan brukes til både (A) in vitro og (B) in vivo avbildning. (A) GFP-positive embryoer brukes til å dissekere netthinner for RGC-oppsamling ved 34 hkf. Dissosierte RGCer er belagt på PDL/lamininbelagte deksler i ZFCM (+)-medier. Vekstkjegleavbildning kan utføres ettersom RGCer utvider axonene sine etter 6-24 timers plating. Celler kan utsettes for ulike behandlinger for å måle de potensielle endringene i H₂O₂-nivåer. Her målte vi_H2O₂-nivåer i vekstkjeglene til RGCer (rød). (B) GFP positive embryoer brukes til in vivo-avbildning. I ønsket alder kan embryoer bedøves og monteres på 35 mm glassbunnsretter for konfikal avbildning. Her er embryoer montert ventrally for retinal avbildning. Skjematisk viser retinal utvikling i sebrafisk. RGCer danner ganglion cellelag (GCL), som er det innerste laget i netthinnen. RGC-axoner utvikler seg til optisk nerve for å krysse midtlinjen, og danner optisk chiasm. Deretter vokser RGC-axoner dorsalt for å lage synapser i det optiske tectum i midbrain. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Alle dyreforsøk ble etisk gjennomgått og godkjent av Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), etter NIH-retningslinjer med protokollen 2006002050 godkjent 24.07.2020. 1. Utarbeidelse av løsninger E2-medier (1x) Forbered 100x E2A (500 ml), 500x E2B (100 ml) og 500x E2C (100 ml) ved å kombinere alle komponentene som vises i tabell 1. Autoklaver E2A-, E2B- og E2C-løsninger. Oppbevars ved 4 °C. For 1x E2-medier: Kombiner 5 ml 100x E2A, 1 ml …

Representative Results

Dyrkede sebrafisk RGCer utvider aksoner innen 1d. Et representativt 405/480-forholdsbilde av H2O2-biosensoren vises i figur 4A. Cellelegemet, axon og vekstkjegler er tydelig synlige i individuelle nevroner. Disse nevronene kan bli utsatt for forskjellige behandlinger over tid for å overvåke H2O2 endringer. Vi har tidligere funnet ut at å legge til 100 μM H2O2 i kulturmedier øker forholdsverdiene, og viser at sanntidsendri…

Discussion

Det er flere kritiske trinn som trenger oppmerksomhet gjennom hele denne protokollen. Vi tror at å vurdere disse punktene vil forbedre den eksperimentelle strømmen. For primær RGC-kultur er steriliteten til ZFCM(-) svært viktig, siden dette kulturmediet ikke inneholder antibiotika og forurensning kan oppstå før eller under avbildning. For å unngå det, anbefaler vi å forberede og bruke ZFCM (-) bare inne i et biosikkerhetsskap og lage ferske ZFCM (-) medier regelmessig (trinn 1.5). I tillegg bør lamininlagrene h…

Materials

35-mm culture dish	Sarstedt	83-3900
35-mm glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes	Sutter/Fisher Scientific	NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher Scientific	C79-500
Cover glass	Corning	2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)	VWR	25384-094
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	26140087
Glucose	Sigma Aldich	G7528
HEPES	Sigma Aldich	H4034
Injection Mold	Adaptive Science Tools	TU-1
Inverted Microscope	Nikon	TE2000
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss	710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red	Gibco/Fisher Scientific	11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
Low melting agarose	Promega	V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
PBS	Hyclone/Fisher Scientific	SH3025601
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Phenol Red	Sigma Aldich	P0290
Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldich	P7629
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	PV820
Poly-D-Lysine (PDL)	Sigma Aldich	P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
Recombinant mouse slit2	R&D Systems	5444-SL-050
Sodium Pyruvate	Sigma Aldich	P5280
Steritop 0.22 µm filter	Millipore	S2GPT05RE
TE Buffer	Ambion	AM9860
Tricaine Methanesulfonate	Sigma Aldich	E10521
Vertical Pipette Puller	David Kopf Instruments	700C