ROS Live Cell Imaging under neuronal utveckling

Summary

Detta protokoll beskriver användningen av en genetiskt kodad väteperoxid (H₂O_2)-biosensori odlade zebrafisk nervceller och larver för att bedöma de fysiologiska signalrollerna för H₂O₂ under nervsystemet utveckling. Det kan appliceras på olika celltyper och modifieras med experimentella behandlingar för att studera reaktiva syrearter (ROS) i allmän utveckling.

Abstract

Reaktiva syrearter (ROS) är väletablerade signalmolekyler, som är viktiga i normal utveckling, homeostas och fysiologi. Bland de olika ROS kännetecknas väteperoxid (H₂O₂) bäst med avseende på roller i cellulär signalering. H₂O₂ har varit inblandad under utvecklingen i flera arter. Till exempel har en övergående ökning av H₂O₂ upptäckts i zebrafiskembryon under de första dagarna efter befruktning. Dessutom försämrar utarmning av en viktig cellulär H₂O_2-källa, NADPH oxidas (NOX), nervsystemets utveckling såsom differentiering, axonal tillväxt och vägledning av retinala ganglionceller (RGCs) både in vivo och in vitro. Här beskriver vi en metod för avbildning intracellulära H₂O_{2 nivåer} i odlade zebrafisk nervceller och hela larver under utveckling med hjälp av den genetiskt kodade H₂O_2-specifikabiosensor, roGFP2-Orp1. Denna sond kan vara övergående eller stabilt uttryckt i zebrafisklarver. Dessutom minskar ratiometric avläsning sannolikheten för att upptäcka artefakter på grund av differentiella genuttryck eller volym effekter. För det första visar vi hur man isolerar och odlar RGCs som härrör från zebrafiskembryon som tillfälligt uttrycker roGFP2-Orp1. Sedan använder vi hela larver för att övervaka H₂O_2-nivåer på vävnadsnivå. Sensorn har validerats genom tillsats av H₂O₂. Dessutom skulle denna metod kunna användas för att mäta H₂O_2-nivåer i specifika celltyper och vävnader genom att generera transgena djur med vävnadsspecifikt biosensoruttryck. Eftersom zebrafisk underlättar genetiska och utvecklingsmässiga manipuleringar, kan det tillvägagångssätt som demonstreras här fungera som en pipeline för att testa rollen som H₂O₂ under neuronal och allmän embryonal utveckling hos ryggradsdjur.

Introduction

Reaktiva syrearter (ROS) signalering reglerar utvecklingen och funktionen hos nervsystemet¹. En viktig cellulär ROS källa är NADPH oxidaser (NOX), som är transmembranproteiner som genererar superoxid och väteperoxid (H₂O₂)². NOX enzymer finns i hela centrala nervsystemet (CNS), och NOX-härledda ROS bidrar till neuronal utveckling^3,4,5,6. Underhåll och differentiering av neurala stamceller, upprättande av neuronal polaritet, neurit utväxt och synaptisk plasticitet har visat sig kräva tillräckliga nivåer av ROS^7,8,9,10,11. Å andra sidan bidrar okontrollerad produktion av ROS av NOXes till neurodegenerativa störningar inklusive Alzheimers sjukdom, multipel skleros och traumatisk hjärnskada^12,13,14. Därför är produktion av fysiologiskt relevant ROS avgörande för att upprätthålla hälsosamma förhållanden.

Utveckling av genetiskt kodade biosensorer underlättade upptäckten av cellulära ROS kraftigt. En viktig fördel med genetiskt kodade biosensorer är den ökade temporala och rumsliga upplösningen av ROS-signalen, eftersom dessa sensorer specifikt kan riktas till olika platser. Redoxkänslig GFP (roGFP) är en typ av sådana ROS-biosensorer. RoGFP2-Orp1-varianten upptäcker specifikt H₂O₂ genom sin Orp1-domän, som är ett glutationperoxiredoxinfamiljprotein från jäst^15,16. Oxidationen av Orp1-proteinet överförs till roGFP2 för att ändra dess konformation (figur 1A). Sonden uppvisar två excitationstoppar nära 405 nm och 480 nm, och en enda utsläppstopp vid 515 nm. Vid oxidation förändras fluorescensintensiteten runt excitationstopparna: medan 405 nm excitation ökar minskar 480 nm excitation. Således är roGFP2-Orp1 en ratiometric biosensor, och H₂O_2-nivåerdetekteras av förhållandet mellan fluorescensintensiteter upphetsade vid två olika våglängder (Figur 1B). Sammantaget är roGFP2-Orp1 ett mångsidigt verktyg för ROS-avbildning som kan användas effektivt in vivo.

Figur 1: Schematisk representation ochexcitationsspektra av roGFP2-Orp1. (A) Oxidantöverföring sker mellan Orp1 och roGFP2 som svar på H₂O_2,vilket leder till konformationsförändringar i roGFP2. B)RoGFP2-Orp1:s excitationsspektra uppvisar två excitationstoppar vid 405 nm och 480 nm och en enda utsläppstopp vid 515 nm. Vid oxidation med H₂O₂ökar excitationen på 405 nm medan 480 nm excitation minskar. Detta resulterar i en ratiometric avläsning för H₂O₂ närvaro. Siffran har ändrats från Bilan och Belousov (2017)¹⁶ och Morgan et al. (2011)²⁵. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Danio rerio (zebrafisk) modellsystem har flera fördelar med att applicera genetiskt kodade biosensorer. Den optiska transparensen hos embryon och larver möjliggör icke-invasiv in vivo-avbildning. Nya bildverktyg utvecklas för att uppnå högre upplösning och djupare penetration¹⁷. Dessutom finns det etablerade verktyg för genetisk manipulering (ectopic mRNA-uttryck, Tol2-transgenes, etc.) och genomredigering (TALENs, CRISPR/ Cas9, etc.), vilket främjar genereringen av transgena djur¹⁸. När zebrafiskembryon utvecklas utanför modern möjliggör detta system ytterligare enklare åtkomst och manipulering av embryona. Till exempel kan encelliga injektioner och läkemedelsbehandlingar enkelt göras.

Här använde vi zebrafisk för att tillfälligt uttrycka H₂O_2-specifikabiosensor roGFP2-Orp1 genom att injicera in vitro-transkriberad mRNA. Dessa embryon kan användas för både in vitro-avbildning av odlade nervceller och in vivo-avbildning (figur 2). Vi beskriver ett protokoll för dissekering och plätering retinal ganglion celler (RGCs) från zebrafish embryon följt av bedömning H₂O₂-nivåer i odlade nervceller. Sedan presenterar vi en metod för in vivo-avbildning av roGFP2-Orp1-uttryckande embryon och larver med konfokal mikroskopi. Detta tillvägagångssätt tillåter inte bara att bestämma fysiologiska H₂O_2-nivåerutan också potentiella förändringar som inträffar i olika utvecklingsstadier eller förhållanden. Sammantaget ger detta system en tillförlitlig metod för att upptäcka H₂O₂ i levande celler och djur för att studera H₂O_{2: s roll} i utveckling, hälsa och sjukdom.

Figur 2. Översikt över det experimentella tillvägagångssättet. Kort, efter embryosamling, injiceras roGFP2-Orp1 mRNA i äggulan av encelliga zebrafiskembryon. Utveckling av embryon kan användas för både (A) in vitro och (B) in vivo imaging. A)GFP-positiva embryon används för att dissekera näthinne för RGC-insamling vid 34 hpf. Dissocierade RGCs pläteras på PDL/lamininbelagda täcken i ZFCM (+) media. Tillväxt kon imaging kan utföras som RGCs utöka sina axons efter 6-24 h plätering. Celler kan utsättas för olika behandlingar för att mäta de potentiella förändringarna i H₂O_2-nivåer. Här mätte vi H₂O_2-nivåeri tillväxtkonerna hos RGCs (röd). B)GFP-positiva embryon används för in vivo-avbildning. Vid önskad ålder kan embryon bedövas och monteras på 35 mm glasbottenfat för konfokal avbildning. Här monteras embryon ventrally för retinal avbildning. Schematiska visar retinal utveckling i zebrafisk. RGCs bildar ganglion cell lager (GCL), som är det innersta skiktet i näthinnan. RGC axoner utvecklas till optisk nerv för att korsa mittlinjen, bilda optik chiasm. Sedan växer RGC-axoner dorsally för att göra synapser i det optiska tectumet i midbrain. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Protocol

Alla djurförsök granskades etiskt och godkändes av Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), i enlighet med NIH:s riktlinjer med protokollet 2006002050 som godkändes den 2020-07-24. 1. Utarbetande av lösningar E2 media (1x) Förbered 100x E2A (500 ml), 500x E2B (100 ml) och 500x E2C (100 mL) lösningar genom att kombinera alla komponenter som visas i tabell 1. Autoklav E2A-, E2B- och E2C-lösningar. Förvara vid 4 °C. För 1x E2-media: Ko…

Representative Results

Odlade zebrafisk RGCs utökar axoner inom 1d. En representativ 405/480-ratio-bild av H2O2-biosensornvisas i figur 4A. Cellkroppen, axon och tillväxt koner är tydligt synliga i enskilda nervceller. Dessa nervceller kan utsättas för olika behandlingar över tid för att övervaka H2O2 förändringar. Vi har tidigare funnit att om man lägger till 100 μM H2O2 till odlingsmedier ökar förhållandesvärdena, vilket visar att …

Discussion

Det finns flera kritiska steg som behöver uppmärksammas i hela protokollet. Vi tror att om man överväger dessa punkter kommer det experimentella flödet att förbättras. För primär RGC-kultur är steriliteten hos ZFCM(-) mycket viktig, eftersom detta kulturmedier inte innehåller antibiotika och förorening kan uppstå före eller under avbildning. För att undvika det rekommenderar vi att du förbereder och använder ZFCM(-) endast inuti ett biosäkerhetsskåp och gör färska ZFCM(-) media regelbundet (steg 1.5)…

Materials

35-mm culture dish	Sarstedt	83-3900
35-mm glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes	Sutter/Fisher Scientific	NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher Scientific	C79-500
Cover glass	Corning	2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm)	VWR	25384-094
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	26140087
Glucose	Sigma Aldich	G7528
HEPES	Sigma Aldich	H4034
Injection Mold	Adaptive Science Tools	TU-1
Inverted Microscope	Nikon	TE2000
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss	710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red	Gibco/Fisher Scientific	11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
Low melting agarose	Promega	V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
PBS	Hyclone/Fisher Scientific	SH3025601
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Phenol Red	Sigma Aldich	P0290
Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldich	P7629
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	PV820
Poly-D-Lysine (PDL)	Sigma Aldich	P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
Recombinant mouse slit2	R&D Systems	5444-SL-050
Sodium Pyruvate	Sigma Aldich	P5280
Steritop 0.22 µm filter	Millipore	S2GPT05RE
TE Buffer	Ambion	AM9860
Tricaine Methanesulfonate	Sigma Aldich	E10521
Vertical Pipette Puller	David Kopf Instruments	700C