تشريح فعال وثقافة الخلايا الظهارية صبغة الفأر الأولية

Summary

يصف هذا البروتوكول ، الذي تم الإبلاغ عنه في الأصل من قبل Fernandez-Godino وآخرون في عام 2016¹، طريقة لعزل خلايا RPE الماوس والثقافة بكفاءة ، والتي تشكل طبقة أحادية RPE وظيفية ومستقطبة في غضون أسبوع واحد على لوحات Transwell. يستغرق الإجراء حوالي 3 ساعات.

Abstract

تؤثر اضطرابات العين على ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم، ولكن محدودية توافر الأنسجة البشرية تعيق دراستهم. نماذج الماوس هي أدوات قوية لفهم الفيزيولوجيا المرضية لأمراض العين بسبب أوجه التشابه بينها وبين التشريح البشري وعلم وظائف الأعضاء. التعديلات في ظهارة صبغ الشبكية (RPE)، بما في ذلك التغيرات في مورفولوجيا ووظيفة، هي السمات المشتركة بين العديد من اضطرابات العين. ومع ذلك، العزلة الناجحة والثقافة من خلايا RPE الماوس الأساسي صعبة للغاية. هذه الورقة هي نسخة سمعية بصرية محدثة من البروتوكول الذي سبق نشره من قبل فرنانديز غودينو وآخرون في عام 2016 لعزل خلايا RPE الأولية للفأر وثقافتها بكفاءة. هذه الطريقة قابلة للاستنساخ للغاية وتؤدي إلى ثقافات قوية من الطبقات الأحادية RPE المستقطبة والمصطبغة للغاية التي يمكن الحفاظ عليها لعدة أسابيع على Transwells. يفتح هذا النموذج آفاقا جديدة لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء أمراض العين. وعلاوة على ذلك، فإنه يوفر منصة لاختبار النهج العلاجية التي يمكن استخدامها لعلاج أمراض العيون الهامة مع الاحتياجات الطبية غير الملباة، بما في ذلك اضطرابات الشبكية الموروثة والضمور البقعي.

Introduction

يصف هذا البروتوكول، الذي تم الإبلاغ عنه في الأصل من قبل Fernandez-Godino وآخرون في عام 2016^1،طريقة لعزل وزراعة خلايا ظهارة صبغة الشبكية (RPE) بكفاءة، والتي تشكل طبقة أحادية RPE وظيفية ومستقطبة في غضون أسبوع واحد على لوحات Transwell. وRPE هو طبقة واحدة تقع في العين بين شبكية العين العصبية وغشاء بروش. تتكون هذه الطبقة الواحدة من خلايا ظهارية مستقطبة ومصطبغة للغاية انضمت إليها تقاطعات ضيقة ، مما يعرض شكلا سداسيا يشبه قرص العسل². على الرغم من هذه البساطة النسيجية الواضحة ، فإن RPE تؤدي مجموعة واسعة من الوظائف الحرجة للشبكية والدورة البصرية العادية^2و3و4. وتشمل الوظائف الرئيسية لطبقة واحدة RPE امتصاص الضوء, تغذية وتجديد مستقبلات ضوئية, إزالة المنتجات النهائية الأيضية, السيطرة على التوازن الأيونية في الفضاء تحت الشبكية والحفاظ على حاجز الدم الشبكية^2,3. كما أن ل RPE دورا هاما في التشكيل المحلي للجهاز المناعي فيالعين^{5و6و7و8و9و10و11.} الضمور و / أو خلل في RPE هي السمات المشتركة بين العديد من اضطرابات العين مثل التهاب الشبكية الصباغي، الليبر الحمى الخلقية، المهق، اعتلال الشبكية السكري، والضمور البقعي^{12،13،14،15}. لسوء الحظ، توافر الأنسجة البشرية محدودة. ونظرا للحفاظ على درجة عالية من التماثل الوراثي مع البشر، نماذج الماوس تمثل أداة مناسبة ومفيدة لدراسة اضطرابات العين^{16،17،18،19}. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الخلايا RPE الأولية المستزرعة يوفر مزايا مثل التلاعب الجيني واختبار المخدرات التي يمكن أن تسرع تطوير علاجات جديدة^لهذهالاضطرابات التي تهدد الرؤية 9^،11.

تفتقر الأساليب الموجودة المتوفرة لعزل RPE الماوس والثقافة بشكل مستنسخ ولا تلخص ميزات RPE في الجسم الحي مع موثوقية كافية. الخلايا تميل إلى فقدان التصبغ، شكل سداسي والمقاومة الكهربائية عبر الإبط (TER) في غضون أيام قليلة في الثقافة^13،20. منذ إنشاء هذه الثقافات الخلية RPE الأولية من الفئران هو عملية صعبة، وقد تم إنشاء هذا البروتوكول الأمثل على أساس بروتوكولات أخرى لعزل خلايا RPE من الفئران وعيون الإنسان^21،22،23 لتشريح عيون الماوس، وجمع RPE والثقافة خلايا RPE الماوس في المختبر.

Protocol

واتبعت المبادئ التوجيهية لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في بحوث العيون والرؤية. ملاحظة: وقد ثبت نجاح هذه الطريقة مع الفئران من خلفيات وراثية مختلفة، بما في ذلك C57BL/6J، B10. D2-HCس H2د H2-T18ج/ oSnJ، والفئران المهق، في مختلف الأعمار. يفضل استخدام الفئران 8 إلى 12 أسبوعا للح?…

Representative Results

وقد استخدم هذا البروتوكول لعزل وزراعة خلايا RPE من الفئران المعدلة وراثيا1. ولم تلاحظ أي اختلافات بين سلالات الفئران أو نوع الجنس. وقد ساعدت النتائج على فهم بعض الجوانب الهامة للآلية الكامنة وراء أمراض العين مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، وهو السبب الأكثر شيوعا لفقدان البص…

Discussion

في حين تم تطوير عدة طرق لعزل خلية RPE الماوس والثقافة قبل^{1،13،20،22،26،27}، طريقة فرنانديز غودينو تستخدم لأول مرة إدراج الغشاء مما يسمح للنمو الفعال للخلايا RPE في الثقافة^{لأسابي?…}

Materials

10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable	BD Biosciences	309604
15 ml centrifuge tube	VWR International	21008-103
50 ml centrifuge tube	VWR International	21008-951
Alpha Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
Angled micro forceps	WPI	501727
Bench-top centrifuge	any
CO2 incubator	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Dissecting microscope	Any
Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium	Gibco	14190144
Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length	WPI	14101
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm	BD Biosciences	353001
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Heat inactivated.
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red	Life Technologies	14175095
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0396
Laminar flow hood	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long	WPI	503216
Non-essential amino acids 100X	Gibco	11140050
N1 Supplement 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-148
Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11	Fisher-Scientific	08-914B
Taurine	Sigma-Aldrich	T-0625
Tissue culture treated 12-well plates	Fisher-Scientific	08-772-29
Tissue culture treated 6-well plates	Fisher-Scientific	14-832-11
Transwell supports 6.5 mm	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
Triiodo-thyronin	Sigma-Aldrich	T-5516
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips	WPI	500232
Vannas Scissors 8cm long, stainless steel	WPI	501790
Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size	Fisher-Scientific	6780-2504