Effektiv dissektion og kultur af primære mus Retinal Pigment Epitel celler
Summary
Denne protokol, som oprindeligt blev rapporteret af Fernandez-Godino et al. i 20161, beskriver en metode til effektivt at isolere og kultur mus RPE celler, som danner en funktionel og polariseret RPE monolayer inden for en uge på Transwell plader. Proceduren tager cirka 3 timer.
Abstract
Øjenlidelser påvirker millioner af mennesker verden over, men den begrænsede tilgængelighed af humane væv hindrer deres undersøgelse. Musemodeller er kraftfulde værktøjer til at forstå patofysiologien af øjensygdomme på grund af deres ligheder med menneskets anatomi og fysiologi. Ændringer i nethindepigmentepitelet (RPE), herunder ændringer i morfologi og funktion, er fælles træk, der deles af mange okulære lidelser. Men en vellykket isolation og kultur af primære mus RPE celler er meget udfordrende. Dette papir er en opdateret audiovisuel version af protokollen, der tidligere blev offentliggjort af Fernandez-Godino et al. i 2016 for effektivt at isolere og kultur primære mus RPE-celler. Denne metode er meget reproducerbar og resulterer i robuste kulturer af stærkt polariserede og pigmenterede RPE monolayers, der kan opretholdes i flere uger på Transwells. Denne model åbner nye veje for studiet af de molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for øjensygdomme. Desuden giver det en platform til at teste terapeutiske tilgange, der kan bruges til behandling af vigtige øjensygdomme med uopfyldte medicinske behov, herunder arvelige nethindeforstyrrelser og makuladegenerationer.
Introduction
Denne protokol, som oprindeligt blev rapporteret af Fernandez-Godino et al. i 20161, beskriver en metode til effektivt at isolere og kultur mus nethinde pigment epitel (RPE) celler, som danner en funktionel og polariseret RPE monolayer inden for en uge på Transwell plader. RPE er en monolayer placeret i øjet mellem den neurale nethinden og Bruch’s membran. Dette ene lag består af stærkt polariserede og pigmenterede epitelceller forbundet med stramme vejkryds, der udviser en sekskantet form, der ligner en honeycomb2. På trods af denne tilsyneladende histologiske enkelhed udfører RPE en lang række funktioner, der er kritiske for nethinden og den normale visuelle cyklus2,3,4. RPE monolayers hovedfunktioner omfatter lysabsorption, næring og fornyelse af fotoreceptorer, fjernelse af metaboliske slutprodukter, kontrol af ionhomøostase i det subretinale rum og vedligeholdelse af blod-nethindebarrieren2,3. RPE har også en vigtig rolle i lokal graduering af immunsystemet i øjet5,6 ,7,8,9,10,11. Degeneration og / eller dysfunktion af RPE er fælles træk deles af mange okulære lidelser såsom retinitis pigmentosa, Leber medfødt amaurosis, albinisme, diabetisk retinopati, og makuladegeneration12,13,14,15. Desværre er tilgængeligheden af humane væv begrænset. I betragtning af deres stærkt bevarede genetiske homologi med mennesker repræsenterer musemodeller et passende og nyttigt værktøj til at studere øjensygdomme16,17,18,19. Desuden giver brugen af dyrkede primære RPE-celler fordele som genmanipulation og lægemiddeltest, der kan fremskynde udviklingen af nye terapier til disse synstruende lidelser9,11.
Eksisterende metoder til rådighed for mus RPE isolation og kultur mangler reproducerbart og ikke opsummere RPE funktioner in vivo med tilstrækkelig pålidelighed. Celler har tendens til at miste pigmentering, sekskantet form og transepithelial elektrisk modstand (TER) inden for et par dage i kultur13,20. Siden etableringen af disse primære RPE-cellekulturer fra mus er en udfordrende proces, er denne optimerede protokol blevet oprettet baseret på andre protokoller til at isolere RPE-celler fra rotte og menneskelige øjne21,22,23 for at dissekere musens øjne, indsamle RPE og kultur musen RPE celler in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens flere metoder til mus RPE celle isolation og kultur var blevet udviklet før1,13,20,22,26,27, Fernandez-Godino metode første gang brugt membran skær giver mulighed for effektiv vækst af RPE celler i kultur i uge1,9. En anden væsentlig ændring i deres protoko…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Ocular Genomics Institute i Massachusetts Eye and Ear.
Materials
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
References
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Konari, K., et al. Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).
- Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).
- Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).
- Hageman, G. S., et al. An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch’s membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).
- Lommatzsch, A., et al. Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).
- Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration. Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).
- Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway. Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Farkas, M. H., et al. Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).
- Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture. Current Eye Research. 31, 739 (2006).
- Schütze, C., et al. Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography. Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Garland, D. L., et al. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).
- Fu, L., et al. The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice. Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).
- Greenwald, S. H., et al. Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease. American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).
- Gupta, P. R., et al. Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects. Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).
- Nandrot, E. F., et al. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin. Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Brydon, E. M., et al. AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).
- Bonilha, V. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).
