Efficiënte dissectie en cultuur van primaire muis retinale pigment epitheelcellen
Summary
Dit protocol, dat oorspronkelijk werd gerapporteerd door Fernandez-Godino et al. in 20161, beschrijft een methode om RPE-cellen van muizen efficiënt te isoleren en te cultiseren, die binnen een week een functionele en gepolariseerde RPE-monolaag vormen op Transwell-platen. De procedure duurt ongeveer 3 uur.
Abstract
Oogaandoeningen treffen miljoenen mensen wereldwijd, maar de beperkte beschikbaarheid van menselijke weefsels belemmert hun studie. Muismodellen zijn krachtige hulpmiddelen om de pathofysiologie van oogziekten te begrijpen vanwege hun overeenkomsten met de menselijke anatomie en fysiologie. Veranderingen in het retinale pigmentepitheel (RPE), waaronder veranderingen in morfologie en functie, zijn veel voorkomende kenmerken die door veel oogaandoeningen worden gedeeld. Succesvolle isolatie en cultuur van rpe-cellen van primaire muizen is echter zeer uitdagend. Dit artikel is een bijgewerkte audiovisuele versie van het protocol dat eerder in 2016 door Fernandez-Godino et al. werd gepubliceerd om primaire RPE-cellen van de muis efficiënt te isoleren en te cultiseren. Deze methode is zeer reproduceerbaar en resulteert in robuuste culturen van sterk gepolariseerde en gepigmenteerde RPE monolagen die enkele weken op Transwells kunnen worden gehandhaafd. Dit model opent nieuwe wegen voor de studie van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan oogziekten. Bovendien biedt het een platform om therapeutische benaderingen te testen die kunnen worden gebruikt om belangrijke oogziekten te behandelen met onvervulde medische behoeften, waaronder erfelijke netvliesaandoeningen en maculadegeneraties.
Introduction
Dit protocol, dat oorspronkelijk werd gerapporteerd door Fernandez-Godino et al. in 20161, beschrijft een methode om muis retinale pigmentepitheelcellen (RPE) efficiënt te isoleren en te cultiseren, die binnen een week een functionele en gepolariseerde RPE-monolaag vormen op Transwell-platen. De RPE is een monolaag in het oog tussen het neurale netvlies en het membraan van de Bruch. Deze enkele laag bestaat uit sterk gepolariseerde en gepigmenteerde epitheelcellen die worden verbonden door nauwe verbindingen, met een zeshoekige vorm die lijkt op een honingraat2. Ondanks deze schijnbare histologische eenvoud voert de RPE een breed scala aan functies uit die van cruciaal belang zijn voor het netvlies en de normale visuele cyclus2,3,4. De belangrijkste functies van de RPE monolaag omvatten lichtabsorptie, voeding en vernieuwing van fotoreceptoren, verwijdering van metabole eindproducten, controle van de ionenhomeostase in de subretinale ruimte en onderhoud van de bloed-retinale barrière2,3. De RPE speelt ook een belangrijke rol in de lokale modulatie van het immuunsysteem in het oog5,6,7,8,9,10,11. Degeneratie en/of disfunctie van de RPE zijn veel voorkomende kenmerken die worden gedeeld door veel oogaandoeningen zoals retinitis pigmentosa, Leber congenitale amaurosis, albinisme, diabetische retinopathie en maculadegeneratie12,13,14,15. Helaas is de beschikbaarheid van menselijke weefsels beperkt. Gezien hun zeer geconserveerde genetische homologie met mensen, vertegenwoordigen muismodellen een geschikt en nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van oogaandoeningen16,17,18,19. Bovendien biedt het gebruik van gekweekte primaire RPE-cellen voordelen zoals genetische manipulatie en medicijntests die de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor deze visiebedreigendeaandoeningenkunnen versnellen 9,11.
Bestaande methoden die beschikbaar zijn voor rpe-isolatie en -cultuur van muizen missen reproduceerbaar en vatten de RPE-functies in vivo niet met voldoende betrouwbaarheid samen. Cellen hebben de neiging om pigmentatie, zeshoekige vorm en transepitheliale elektrische weerstand (TER) binnen een paar dagen in cultuur13,20te verliezen . Aangezien het vaststellen van deze primaire RPE-celculturen van muizen een uitdagend proces is, is dit geoptimaliseerde protocol gemaakt op basis van andere protocollen om RPE-cellen te isoleren van ratten en menselijke ogen21,22, 23 om de muisogen te ontleden, de RPE te verzamelen en de RPE-cellen van de muis in vitro te culteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terwijl verscheidene methodes voor muis RPE celisolatie en cultuur vóór1, 13,20,22,26, 27waren ontwikkeld, gebruikte de methode van Fernandez-Godino eerst membraaninzetstukken die de efficiënte groei van de cellen RPE in cultuur voor week1,9toestaan . Een andere be…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Ocular Genomics Institute in Massachusetts Eye and Ear.
Materials
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
References
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Konari, K., et al. Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).
- Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).
- Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).
- Hageman, G. S., et al. An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch’s membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).
- Lommatzsch, A., et al. Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).
- Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration. Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).
- Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway. Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Farkas, M. H., et al. Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).
- Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture. Current Eye Research. 31, 739 (2006).
- Schütze, C., et al. Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography. Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Garland, D. L., et al. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).
- Fu, L., et al. The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice. Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).
- Greenwald, S. H., et al. Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease. American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).
- Gupta, P. R., et al. Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects. Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).
- Nandrot, E. F., et al. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin. Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Brydon, E. M., et al. AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).
- Bonilha, V. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).
