Dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario

Summary

Questo protocollo, originariamente riportato da Fernandez-Godino et al. La procedura dura circa 3 ore.

Abstract

I disturbi oculari colpiscono milioni di persone in tutto il mondo, ma la limitata disponibilità di tessuti umani ostacola il loro studio. I modelli di topo sono strumenti potenti per comprendere la fisiopatologia delle malattie oculari a causa delle loro somiglianze con l’anatomia e la fisiologia umana. Le alterazioni dell’epitelio pigmentato retinico (RPE), inclusi i cambiamenti nella morfologia e nella funzione, sono caratteristiche comuni condivise da molti disturbi oculari. Tuttavia, l’isolamento e la coltura di successo delle cellule RPE del topo primario sono molto impegnativi. Questo documento è una versione audiovisiva aggiornata del protocollo precedentemente pubblicato da Fernandez-Godino et al. Questo metodo è altamente riproducibile e si traduce in solide colture di monostrati RPE altamente polarizzati e pigmentati che possono essere mantenuti per diverse settimane su Transwells. Questo modello apre nuove strade per lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari alla base delle malattie oculari. Inoltre, fornisce una piattaforma per testare approcci terapeutici che possono essere utilizzati per trattare importanti malattie oculari con esigenze mediche non soddisfatte, compresi disturbi ereditari della retina e degenerazioni maculari.

Introduction

Questo protocollo, originariamente riportato da Fernandez-Godino et al. L’RPE è un monostrato situato nell’occhio tra la retina neurale e la membrana di Bruch. Questo singolo strato è costituito da cellule epiteliali altamente polarizzate e pigmentate unite da giunzioni strette, che presentano una forma esagonale che ricorda un nido d’ape². Nonostante questa apparente semplicità istologica, l’RPE svolge un’ampia varietà di funzioni critiche per la retina e il normale ciclo^{visivo 2,3,4}. Le funzioni principali del monostrato RPE includono l’assorbimento della luce, il nutrimento e il rinnovamento dei fotorecettori, la rimozione dei prodotti finali metabolici, il controllo dell’omeostasi ionica nello spazio subretinale e il mantenimento della barriera emato-retinica^2,3. L’RPE ha anche un ruolo importante nella modulazione locale del sistema immunitario nell’occhio^{5,6,7,8,9,10,11}. Degenerazione e/o disfunzione dell’RPE sono caratteristiche comuni condivise da molti disturbi oculari come retinite pigmentosa, amaurosi congenita di Leber, albinismo, retinopatia diabetica e degenerazione maculare^12,13,14,15. Sfortunatamente, la disponibilità di tessuti umani è limitata. Data la loro omologia genetica altamente conservata con l’uomo, i modelli di topo rappresentano uno strumento adatto e utile per studiare i disturbi^{oculari 16,17,18,19}. Inoltre, l’uso di cellule RPE primarie coltivate offre vantaggi come la manipolazione genetica e il test farmacologico che possono accelerare lo sviluppo di nuove terapie per questi disturbi potenzialmente^{letali per la vista 9,11}.

I metodi esistenti disponibili per l’isolamento e la coltura dell’RPE del mouse mancano in modo riproducibile e non ricapitolano le funzionalità RPE in vivo con sufficiente affidabilità. Le cellule tendono a perdere pigmentazione, forma esagonale e resistenza elettrica transepiteliale (TER) entro pochi giorni in^{coltura 13,20}. Poiché stabilire queste colture primarie di cellule RPE dai topi è un processo impegnativo, questo protocollo ottimizzato è stato creato sulla base di altri protocolli per isolare le cellule RPE dal ratto e dagli occhi^{umani 21,22,23 per} sezionare gli occhi del mouse, raccogliere l’RPE e coltura le cellule RPE del topo in vitro.

Protocol

Sono state seguite le linee guida della dichiarazione ARVO per l’uso degli animali nella ricerca oftalmica e della visione. NOTA: Questo metodo si è dimostrato efficace con topi di diversa origine genetica, tra cui C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ, e topi albini, a varie età. Preferibilmente utilizzare topi da 8 a 12 settimane per ottenere cellule RPE. Le cellule RPE dei topi più anziani proliferano meno in coltura e i topi più giovani hanno sempre pi…

Representative Results

Questo protocollo è stato utilizzato per isolare e coltura cellule RPE da topi geneticamente modificati1. Non sono state osservate differenze tra ceppi di topi o sesso. I risultati hanno contribuito a comprendere alcuni aspetti importanti del meccanismo alla base delle malattie oculari come la degenerazione maculare legata all’età, che è la causa più comune di perdita della vista tra gli anziani9. Le cellule RPE isolate a seguito di questo protocollo sono state completa…

Discussion

Mentre diversi metodi per l’isolamento e la coltura delle cellule RPE del topo^{erano stati sviluppati prima di 1,13,20,22}, 26^,27, il metodo di Fernandez-Godino ha utilizzato per la prima volta inserti a membrana che consentono la crescita efficiente delle cellule RPE in^{coltura per le settimane 1,9<…}

Materials

10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable	BD Biosciences	309604
15 ml centrifuge tube	VWR International	21008-103
50 ml centrifuge tube	VWR International	21008-951
Alpha Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
Angled micro forceps	WPI	501727
Bench-top centrifuge	any
CO2 incubator	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Dissecting microscope	Any
Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium	Gibco	14190144
Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length	WPI	14101
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm	BD Biosciences	353001
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Heat inactivated.
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red	Life Technologies	14175095
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0396
Laminar flow hood	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long	WPI	503216
Non-essential amino acids 100X	Gibco	11140050
N1 Supplement 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-148
Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11	Fisher-Scientific	08-914B
Taurine	Sigma-Aldrich	T-0625
Tissue culture treated 12-well plates	Fisher-Scientific	08-772-29
Tissue culture treated 6-well plates	Fisher-Scientific	14-832-11
Transwell supports 6.5 mm	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
Triiodo-thyronin	Sigma-Aldrich	T-5516
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips	WPI	500232
Vannas Scissors 8cm long, stainless steel	WPI	501790
Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size	Fisher-Scientific	6780-2504