一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

Summary

このプロトコルは、2016年1年にフェルナンデス・ゴディーノらによって報告されたもので、トランスウェルプレート上で1週間以内に機能的で偏極したRPE単層を形成するマウスRPE細胞を効率的に単離および培養する方法を説明している。手続きには約3時間かかります。

Abstract

眼疾患は世界中の何百万人もの人々に影響を与えますが、人間の組織の利用可能性が限られていると研究が妨げられています。マウスモデルは、人体解剖学や生理学と類似しているため、眼疾患の病態生理を理解するための強力なツールです。網膜色素上皮(RPE)の変化は、形態および機能の変化を含め、多くの眼疾患によって共有される共通の特徴である。しかし、プライマリマウスRPE細胞の分離と培養は非常に困難です。この論文は、フェルナンデス・ゴディーノら2016年に発表されたプロトコルの更新された視聴覚バージョンであり、プライマリマウスRPE細胞を効率的に単離して培養する。この方法は非常に再現性が高く、トランスウェルズで数週間維持できる高度に偏光性および色素性の高いRPE単層の堅牢な培養を生じる。このモデルは、眼疾患の根底にある分子および細胞メカニズムの研究のための新しい道を開く。さらに、遺伝性の疾患や黄斑の過大代を含む、満たされていない医療ニーズを持つ重要な眼疾患を治療するために使用できる治療アプローチをテストするためのプラットフォームを提供します。

Introduction

このプロトコルは、2016年1年にフェルナンデス・ゴディーノらによって報告されたもので、トランスウェルプレート上で1週間以内に機能的で偏極したRPE単層を形成するマウス網膜色素上皮(RPE)細胞を効率的に単離および培養する方法を説明している。RPEは、神経性のレティナとブルッフの膜の間の目に位置する単層である。この単層は、高偏光性および色素上皮細胞で構成され、密接する接合によって結合され、ハニカム²に似た六角形の形状を呈する。この明らかな組織学的な単純さにもかかわらず、RPEは、レチナおよび正常な視覚サイクル^2、3、4に不可欠な多種多様な機能を実行する。RPE単層の主な機能は、光吸収、感光体の栄養および再生、代謝末端産物の除去、経皮下腔内のイオン恒常性の制御および血液-筋バリア^2、3の維持を含む。RPEはまた、眼^{5、6、7、8、9、10、11}の免疫系の局所的な調節において重要な役割^を果^{たしている}。RPEの変性および/または機能不全は、網膜色素変性症、レーバー先天性アマウロシス、アルビニズム、糖尿病性網膜症、および黄斑変性^症12、13、14、15のような多くの眼疾患によって共有される共通の特徴である。残念ながら、人間の組織の入手可能性は限られています。人間との高度に保存された遺伝的相同性を考えると、マウスモデルは、眼疾患^{16、17、18、19}を研究するための適切で有用なツールを表す。さらに、培養された一次RPE細胞の使用は、これらの視力を脅かす障害^9,11に対する新たな治療法の開発を加速することができる遺伝子操作および薬物検査などの利点を提供する。

マウスのRPEの分離と培養に利用可能な既存の方法は再現性に欠け、十分な信頼性を持つ生体内のRPE機能を再現しません。細胞は、培養^13,20において数日内に色素沈着、六角形および後上皮電気抵抗(TER)を失う傾向がある。マウスからこれらの主要なRPE細胞培養を確立することは困難なプロセスであるため、この最適化されたプロトコルは、ラットおよびヒトの目^21、22、23からRPE細胞を分離してマウスの目を解剖し、インビトロでマウスRPE細胞を培養する他のプロトコルに基づいて作成された。

Protocol

眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明のガイドラインに従った。 注:この方法は、C57BL / 6J、B10を含む異なる遺伝的背景のマウスで成功することが証明されています。D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ,およびアルビノマウスは、様々な年齢で。好ましくは、RPE細胞を得るために8〜12週齢のマウスを使用する。古いマウスのRPE細胞は培養中に増殖?…

Representative Results

このプロトコルは、遺伝子組み換えマウス1からRPE細胞を単離および培養するために使用されてきた。マウス株や性別の間に違いは認められてはいない。この結果は、高齢者9の視力低下の最も一般的な原因である加齢黄斑変性症などの眼疾患のメカニズムの重要な側面を理解するのに役立った。このプロトコルに従って単離されたRPE細胞は、播種後24時間後…

Discussion

マウスRPE細胞の分離および培養のためのいくつかの方法は、1、13、20、22、26、27の前に開発されていたが、フェルナンデス・ゴディーノの方法は、最初に培養^1、9の培養でRPE細胞の効率的な増殖を可能…

Materials

10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable	BD Biosciences	309604
15 ml centrifuge tube	VWR International	21008-103
50 ml centrifuge tube	VWR International	21008-951
Alpha Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
Angled micro forceps	WPI	501727
Bench-top centrifuge	any
CO2 incubator	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Dissecting microscope	Any
Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium	Gibco	14190144
Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length	WPI	14101
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm	BD Biosciences	353001
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Heat inactivated.
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red	Life Technologies	14175095
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0396
Laminar flow hood	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long	WPI	503216
Non-essential amino acids 100X	Gibco	11140050
N1 Supplement 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-148
Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11	Fisher-Scientific	08-914B
Taurine	Sigma-Aldrich	T-0625
Tissue culture treated 12-well plates	Fisher-Scientific	08-772-29
Tissue culture treated 6-well plates	Fisher-Scientific	14-832-11
Transwell supports 6.5 mm	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
Triiodo-thyronin	Sigma-Aldrich	T-5516
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips	WPI	500232
Vannas Scissors 8cm long, stainless steel	WPI	501790
Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size	Fisher-Scientific	6780-2504