このプロトコルは、2016年1年にフェルナンデス・ゴディーノらによって報告されたもので、トランスウェルプレート上で1週間以内に機能的で偏極したRPE単層を形成するマウスRPE細胞を効率的に単離および培養する方法を説明している。手続きには約3時間かかります。
眼疾患は世界中の何百万人もの人々に影響を与えますが、人間の組織の利用可能性が限られていると研究が妨げられています。マウスモデルは、人体解剖学や生理学と類似しているため、眼疾患の病態生理を理解するための強力なツールです。網膜色素上皮(RPE)の変化は、形態および機能の変化を含め、多くの眼疾患によって共有される共通の特徴である。しかし、プライマリマウスRPE細胞の分離と培養は非常に困難です。この論文は、フェルナンデス・ゴディーノら2016年に発表されたプロトコルの更新された視聴覚バージョンであり、プライマリマウスRPE細胞を効率的に単離して培養する。この方法は非常に再現性が高く、トランスウェルズで数週間維持できる高度に偏光性および色素性の高いRPE単層の堅牢な培養を生じる。このモデルは、眼疾患の根底にある分子および細胞メカニズムの研究のための新しい道を開く。さらに、遺伝性の疾患や黄斑の過大代を含む、満たされていない医療ニーズを持つ重要な眼疾患を治療するために使用できる治療アプローチをテストするためのプラットフォームを提供します。
このプロトコルは、2016年1年にフェルナンデス・ゴディーノらによって報告されたもので、トランスウェルプレート上で1週間以内に機能的で偏極したRPE単層を形成するマウス網膜色素上皮(RPE)細胞を効率的に単離および培養する方法を説明している。RPEは、神経性のレティナとブルッフの膜の間の目に位置する単層である。この単層は、高偏光性および色素上皮細胞で構成され、密接する接合によって結合され、ハニカム2に似た六角形の形状を呈する。この明らかな組織学的な単純さにもかかわらず、RPEは、レチナおよび正常な視覚サイクル2、3、4に不可欠な多種多様な機能を実行する。RPE単層の主な機能は、光吸収、感光体の栄養および再生、代謝末端産物の除去、経皮下腔内のイオン恒常性の制御および血液-筋バリア2、3の維持を含む。RPEはまた、眼5、6、7、8、9、10、11の免疫系の局所的な調節において重要な役割を果たしている。RPEの変性および/または機能不全は、網膜色素変性症、レーバー先天性アマウロシス、アルビニズム、糖尿病性網膜症、および黄斑変性症12、13、14、15のような多くの眼疾患によって共有される共通の特徴である。残念ながら、人間の組織の入手可能性は限られています。人間との高度に保存された遺伝的相同性を考えると、マウスモデルは、眼疾患16、17、18、19を研究するための適切で有用なツールを表す。さらに、培養された一次RPE細胞の使用は、これらの視力を脅かす障害9,11に対する新たな治療法の開発を加速することができる遺伝子操作および薬物検査などの利点を提供する。
マウスのRPEの分離と培養に利用可能な既存の方法は再現性に欠け、十分な信頼性を持つ生体内のRPE機能を再現しません。細胞は、培養13,20において数日内に色素沈着、六角形および後上皮電気抵抗(TER)を失う傾向がある。マウスからこれらの主要なRPE細胞培養を確立することは困難なプロセスであるため、この最適化されたプロトコルは、ラットおよびヒトの目21、22、23からRPE細胞を分離してマウスの目を解剖し、インビトロでマウスRPE細胞を培養する他のプロトコルに基づいて作成された。
マウスRPE細胞の分離および培養のためのいくつかの方法は、1、13、20、22、26、27の前に開発されていたが、フェルナンデス・ゴディーノの方法は、最初に培養1、9の培養でRPE細胞の効率的な増殖を可能…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、マサチューセッツ眼と耳の眼ゲノミクス研究所によって支えられた。
10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
Bench-top centrifuge | any | ||
CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
Dissecting microscope | Any | ||
Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |