Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário
Summary
Este protocolo, que foi originalmente relatado por Fernandez-Godino et al. em 20161,descreve um método para isolar eficientemente e cultivar células RPE do mouse, que formam uma monocamada RPE funcional e polarizada dentro de uma semana em placas Transwell. O procedimento leva aproximadamente 3 horas.
Abstract
Os distúrbios oculares afetam milhões de pessoas em todo o mundo, mas a disponibilidade limitada de tecidos humanos dificulta seu estudo. Modelos de camundongos são ferramentas poderosas para entender a fisiopatologia de doenças oculares devido às suas semelhanças com a anatomia humana e a fisiologia. Alterações no epitélio pigmento da retina (RPE), incluindo alterações na morfologia e função, são características comuns compartilhadas por muitas doenças oculares. No entanto, o isolamento bem sucedido e a cultura das células RPE do mouse primário é muito desafiador. Este artigo é uma versão audiovisual atualizada do protocolo publicado anteriormente por Fernandez-Godino et al. em 2016 para isolar e cultivar eficientemente células RPE do mouse primário. Este método é altamente reproduzível e resulta em culturas robustas de monocamadas RPE altamente polarizadas e pigmentadas que podem ser mantidas por várias semanas na Transwells. Este modelo abre novos caminhos para o estudo dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes às doenças oculares. Além disso, fornece uma plataforma para testar abordagens terapêuticas que podem ser usadas para tratar doenças oculares importantes com necessidades médicas não atendidas, incluindo distúrbios hereditários da retina e degenerações maculares.
Introduction
Este protocolo, que foi originalmente relatado por Fernandez-Godino et al. em 20161,descreve um método para isolar eficientemente e cultivar células de pigmento de retina de camundongos (RPE), que formam uma monocamada RPE funcional e polarizada dentro de uma semana em placas transwell. O RPE é uma monocamada localizada no olho entre a retina neural e a membrana do Bruch. Esta camada única consiste em células epiteliais altamente polarizadas e pigmentadas unidas por junções apertadas, exibindo uma forma hexagonal que se assemelha a um favo de mel2. Apesar dessa aparente simplicidade histológica, o RPE executa uma grande variedade de funções críticas à retina e ao ciclo visual normal2,3,4. As principais funções da monocamada RPE incluem absorção de luz, nutrição e renovação de fotorreceptores, remoção de produtos finais metabólicos, controle da homeostase de íon no espaço subretral e manutenção da barreira hemintária2,3. O RPE também tem um papel importante na modulação local do sistema imunológico no olho5,6,7,8,9,10,11. Degeneração e/ou disfunção do RPE são características comuns compartilhadas por muitas doenças oculares como retinite pigmentosa, amaurose congênita leber, albinismo, retinopatia diabética e degeneração macular12,13,14,15. Infelizmente, a disponibilidade de tecidos humanos é limitada. Dada a sua homologia genética altamente conservada com humanos, os modelos de camundongos representam uma ferramenta adequada e útil para o estudo de distúrbios oculares16,17,18,19. Além disso, o uso de células RPE primárias cultivadas proporciona vantagens como manipulação genética e testes de drogas que podem acelerar o desenvolvimento de novas terapias para esses transtornos que ameaçam a visão9,11.
Os métodos existentes disponíveis para isolamento e cultura de RPE do mouse carecem de reprodutivelmente e não recapitulam os recursos RPE in vivo com confiabilidade suficiente. As células tendem a perder pigmentação, forma hexagonal e resistência elétrica transeptelial (TER) dentro de poucos dias na cultura13,20. Uma vez que estabelecer essas culturas primárias de células RPE a partir de camundongos é um processo desafiador, este protocolo otimizado foi criado com base em outros protocolos para isolar células RPE de ratos e olhos humanos21,22,23 para dissecar os olhos do rato, coletar o RPE e cultivar as células RPE do mouse in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enquanto vários métodos para o isolamento e cultura das células RPE do camundongo haviam sido desenvolvidos antesde 1,13,20,22,26,27, o método de Fernandez-Godino usou pela primeira vez inserções de membrana permitindo o crescimento eficiente das células RPE na cultura durante as semanas1,<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Genômica Ocular em Massachusetts Eye and Ear.
Materials
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
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