Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario
Summary
Este protocolo, que fue reportado originalmente por Fernandez-Godino et al. en 20161,describe un método para aislar eficientemente y cultivo de células RPE del ratón, que forman una monocapa RPE funcional y polarizada dentro de una semana en las placas Transwell. El procedimiento dura aproximadamente 3 horas.
Abstract
Los trastornos oculares afectan a millones de personas en todo el mundo, pero la limitada disponibilidad de tejidos humanos dificulta su estudio. Los modelos de ratón son potentes herramientas para entender la fisiopatología de las enfermedades oculares debido a sus similitudes con la anatomía humana y la fisiología. Las alteraciones en el epitelio pigmentario retiniano (RPE), incluidos los cambios en la morfología y la función, son características comunes compartidas por muchos trastornos oculares. Sin embargo, el aislamiento exitoso y la cultura de las células RPE del ratón primario es muy difícil. Este artículo es una versión audiovisual actualizada del protocolo publicado previamente por Fernandez-Godino et al. en 2016 para aislar eficientemente y cultura células RPE de ratón primario. Este método es altamente reproducible y resulta en cultivos robustos de monocapas RPE altamente polarizadas y pigmentadas que se pueden mantener durante varias semanas en Transwells. Este modelo abre nuevas vías para el estudio de los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a las enfermedades oculares. Además, proporciona una plataforma para probar enfoques terapéuticos que se pueden utilizar para tratar enfermedades oculares importantes con necesidades médicas insatisfechas, incluyendo trastornos hereditarios de la retina y degeneraciones maculares.
Introduction
Este protocolo, que fue reportado originalmente por Fernandez-Godino et al. en 20161,describe un método para aislar y cultivo eficientemente ratones células de epitelio pigmentario retiniano (RPE), que forman una monocapa RPE funcional y polarizada dentro de una semana en las placas Transwell. El RPE es una monocapa situada en el ojo entre la retina neural y la membrana del Bruch. Esta sola capa consiste en células epiteliales altamente polarizadas y pigmentadas unidas por uniones estrechas, exhibiendo una forma hexagonal que se asemeja a un panal de abeja2. A pesar de esta aparente simplicidad histológica, el RPE realiza una amplia variedad de funciones críticas para la retina y el ciclo visual normal2,3,4. Las principales funciones de la monocapa RPE incluyen absorción de luz, nutrición y renovación de fotorreceptores, eliminación de productos finales metabólicos, control de la homeostasis iónica en el espacio subretinal y mantenimiento de la barrera blood -retinal2,3. El RPE también tiene un papel importante en la modulación local del sistema inmunológico en el ojo5,6,7,8,9,10,11. La degeneración y/o disfunción de la RPE son características comunes compartidas por muchos trastornos oculares como retinitis pigmentosa, amaurosis congénita de Leber, albinismo, retinopatía diabética y degeneración macular12,13,14,15. Desafortunadamente, la disponibilidad de tejidos humanos es limitada. Dada su homología genética altamente conservada con humanos, los modelos de ratón representan una herramienta adecuada y útil para estudiar los trastornos oculares16,17,18,19. Además, el uso de células RPE primarias cultivadas proporciona ventajas como la manipulación genética y las pruebas farmacológicas que pueden acelerar el desarrollo de nuevas terapias para estos trastornos potencialmente mortales de la visión9,11.
Los métodos existentes disponibles para el aislamiento y la referencia cultural RPE del ratón carecen de reproducibilidad y no recapitulan las características RPE in vivo con suficiente fiabilidad. Las células tienden a perder pigmentación, forma hexagonal y resistencia eléctrica transepithelial (TER) en pocos días en el cultivo13,20. Dado que establecer estos cultivos celulares RPE primarios a partir de ratones es un proceso desafiante, este protocolo optimizado se ha creado sobre la base de otros protocolos para aislar las células RPE de los ojos de rata y humanos21,22,23 para diseccionar los ojos del ratón, recoger el RPE y cultivar las células RPE del ratón in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mientras que varios métodos para el aislamiento y cultivo celular RPE del ratón se habían desarrollado antesde 1,13,20,22,26,27, el método de Fernández-Godino utilizó por primera vez insertos de membrana que permiten el crecimiento eficiente de las células RPE en el cultivo durante las semanas1,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Instituto de Genómica Ocular en Massachusetts Eye and Ear.
Materials
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
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