Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen
Summary
Dieses Protokoll, das ursprünglich von Fernandez-Godino et al. im Jahr 20161berichtet wurde, beschreibt eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultur von Maus-RPE-Zellen, die innerhalb einer Woche auf Transwell-Platten eine funktionelle und polarisierte RPE-Monoschicht bilden. Das Verfahren dauert ca. 3 Stunden.
Abstract
Augenerkrankungen betreffen Millionen von Menschen weltweit, aber die begrenzte Verfügbarkeit von menschlichem Gewebe behindert ihre Studie. Mausmodelle sind mächtige Werkzeuge, um die Pathophysiologie von Augenkrankheiten aufgrund ihrer Ähnlichkeiten mit der menschlichen Anatomie und Physiologie zu verstehen. Veränderungen im retinalen Pigmentepithel (RPE), einschließlich Veränderungen in Morphologie und Funktion, sind häufige Merkmale, die von vielen Augenerkrankungen geteilt werden. Eine erfolgreiche Isolierung und Kultur der primären Maus-RPE-Zellen ist jedoch eine große Herausforderung. Dieses Papier ist eine aktualisierte audiovisuelle Version des Protokolls, das zuvor von Fernandez-Godino et al. im Jahr 2016 veröffentlicht wurde, um primäre Maus-RPE-Zellen effizient zu isolieren und zu kultivieren. Diese Methode ist sehr reproduzierbar und führt zu robusten Kulturen hochpolarisierter und pigmentierter RPE-Monolayer, die mehrere Wochen lang auf Transwells gepflegt werden können. Dieses Modell eröffnet neue Wege für die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, die Augenkrankheiten zugrunde liegen. Darüber hinaus bietet es eine Plattform, um therapeutische Ansätze zu testen, die verwendet werden können, um wichtige Augenkrankheiten mit unerfüllten medizinischen Bedürfnissen zu behandeln, einschließlich vererbter Netzhauterkrankungen und Makuladegenerationen.
Introduction
Dieses Protokoll, das ursprünglich von Fernandez-Godino et al. im Jahr 20161berichtet wurde, beschreibt eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultur von retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) der Maus, die innerhalb einer Woche auf Transwell-Platten eine funktionelle und polarisierte RPE-Monoschicht bilden. Die RPE ist eine Monoschicht im Auge zwischen der neuronalen Netzhaut und der Bruch-Membran. Diese einzelne Schicht besteht aus hochpolarisierten und pigmentierten Epithelzellen, die durch enge Kreuzungen verbunden sind und eine sechseckige Form aufweisen, die einer Wabe2ähnelt. Trotz dieser scheinbaren histologischen Einfachheit führt das RPE eine Vielzahl von Funktionen aus, die für die Netzhaut und den normalen visuellen Zyklus2,3,4entscheidend sind. Die Hauptfunktionen der RPE-Monoschicht sind Lichtabsorption, Ernährung und Erneuerung von Photorezeptoren, Entfernung von metabolischen Endprodukten, Kontrolle der Ionenhomöostase im subretinalen Raum und Aufrechterhaltung der Blut-Retina-Barriere2,3. Das RPE hat auch eine wichtige Rolle bei der lokalen Modulation des Immunsystems im Auge5,6,7,8,9,10,11. Degeneration und/oder Dysfunktion des RPE sind gemeinsame Merkmale von vielen Augenerkrankungen wie Retinitis pigmentosa, Leber angeborene Amaurose, Albinismus, diabetische Retinopathie, und Makuladegeneration12,13,14,15. Leider ist die Verfügbarkeit von menschlichem Gewebe begrenzt. Aufgrund ihrer hochkonservierten genetischen Homologie mit Menschen stellen Mausmodelle ein geeignetes und nützliches Werkzeug zum Studium von Augenerkrankungendar 16,17,18,19. Darüber hinaus bietet die Verwendung von kultivierten primären RPE-Zellen Vorteile wie genetische Manipulation und Arzneimitteltests, die die Entwicklung neuer Therapien für diese sehbedrohlichen Erkrankungen beschleunigen können9,11.
Vorhandene Methoden, die für die RPE-Isolation und -Kultur der Maus verfügbar sind, fehlen reproduzierbar und rekapitulieren die RPE-Funktionen in vivo nicht mit ausreichender Zuverlässigkeit. Zellen neigen dazu, Pigmentierung, sechseckige Form und transepitheliale elektrische Beständigkeit (TER) innerhalb weniger Tage in Kultur13,20zu verlieren. Da die Etablierung dieser primären RPE-Zellkulturen von Mäusen ein anspruchsvoller Prozess ist, wurde dieses optimierte Protokoll auf der Grundlage anderer Protokolle erstellt, um RPE-Zellen von Ratten- und menschlichen Augen zu isolieren21,22,23, um die Mausaugen zu sezieren, die RPE zu sammeln und die Maus-RPE-Zellen in vitro zu kultivieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während mehrere Methoden für die Mürmaus-RPE-Zellisolierung und -kultur vor1,13,20,22,26,27entwickelt worden waren, verwendete Fernandez-Godinos Methode erstmals Membraneinsätze, die das effiziente Wachstum der RPE-Zellen in kultur für Wochen1 ,9ermöglichten. Ei…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Ocular Genomics Institute in Massachusetts Eye and Ear unterstützt.
Materials
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
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