Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung von Veränderungen der afferenten Neuronenaktivität während motorischer Befehle in einem Modell-Wirbeltier-Haarzellsystem.
Sensorische Systeme sammeln Hinweise, die für die Steuerung des Verhaltens unerlässlich sind, aber Tiere müssen entschlüsseln, welche Informationen biologisch relevant sind. Die Fortbewegung erzeugt reafferente Hinweise, die Tiere von relevanten sensorischen Hinweisen der Umgebung entwirren müssen. Wenn beispielsweise ein Fisch schwimmt, wird der aus Körperandulationen erzeugte Fluss von den mechanorezeptiven Neuromasten erkannt, die aus Haarzellen bestehen, aus denen das Seitenliniensystem besteht. Die Haarzellen übertragen dann flüssige Bewegungsinformationen vom Sensor über die sensorisch afferenten Neuronen an das Gehirn. Gleichzeitig wird die Folgeentladung des Motorbefehls an die Haarzellen weitergeleitet, um eine Reizüberflutung zu verhindern. Die Berücksichtigung der hemmenden Wirkung prädiktiver motorischer Signale während der Fortbewegung ist daher bei der Bewertung der Empfindlichkeit des Seitenliniensystems von entscheidender Bedeutung. Wir haben einen elektrophysiologischen In-vivo-Ansatz entwickelt, um gleichzeitig die aktivität des hinteren lateralen Line afferenten Neurons und der ventralen motorischen Wurzel bei Zebrafischlarven (4-7 Tage nach der Befruchtung) zu überwachen, die mehrere Stunden dauern können. Extrazelluläre Aufnahmen von afferenten Neuronen werden mit der Loose Patch Clamp-Technik erreicht, die Die Aktivität einzelner oder mehrerer Neuronen erkennen kann. Ventrale Wurzelaufnahmen werden durch die Haut mit Glaselektroden durchgeführt, um die Aktivität von Motoneuronen zu erkennen. Unser experimentelles Protokoll bietet das Potenzial, endogene oder evozierte Veränderungen des sensorischen Inputs über motorisches Verhalten in einem intakten, sich verhaltenden Wirbeltier zu überwachen.
Affente Neuronen mechanosensorischer Systeme übertragen während des Hörens und Gleichgewichts Informationen von Haarzellen an das Gehirn. Die Elektrophysiologie kann die Empfindlichkeit afferenter Neuronen durch direkte Aufnahmen aufdecken. Während das Patchen ganzer Zellen aus Haarzellen eine Herausforderung sein kann, ist die Aufzeichnung von nachgeschalteten afferenten Neuronen einfacher und ermöglicht die Beurteilung von Aktionspotentialen als Reaktion auf kontrollierte Stimulationen1,2,3. Stimulierende Haarzellen führen zu ihrer Ablenkung, die mechanosensorische Strukturen verändert und so eine Zunahme der Aktionspotentiale (Spikes) in verschiedenen Neuronenauslöst 4,5,6. In Abwesenheit äußerer Reize steigen afferent neuronen auch spontan aufgrund von Glutamatlecks aus den Haarzellen auf die afferenten postsynaptischen Terminals7,8und tragen nachweislich zur Aufrechterhaltung der Empfindlichkeit bei9,10. Die Patch-Clamp-Aufzeichnung der afferenten Aktivität ermöglicht die Beobachtung der Empfindlichkeit und Signaldynamik von Haarzellen, die mit Techniken mit geringerer zeitlicher Auflösung nicht möglich sind, wie z.B. in der Mikrophonik11,12 oder funktionellen Calcium-Bildgebung13,14,15. Das folgende Protokoll ermöglicht die Aufzeichnung afferenter Aktivität gleichzeitig mit motorischen Befehlen, um sofortige Veränderungen der Haarzellempfindlichkeit aufzudecken.
Zebrafische (Danio rerio) verwenden Haarzellen, die in Neuromasten enthalten sind, die das Seitenliniensystem bilden, um Wasserbewegungen relativ zu ihrem Körper zu erkennen, die in neuronale Signale übersetzt werden, die für die Navigation unerlässlich sind16,17,18, Raubtiervermeidung, Beutefang19,20und Schulung21. Der Wasserfluss kann auch durch die Bewegungen des Schwimmens22 , 23,24, Atmung22 , 25,26und Fütterung27selbst erzeugt werden. Diese Verhaltensweisen umfassen sich wiederholende Bewegungen, die Haarzellen ermüden und die Wahrnehmung beeinträchtigen können. Daher ist es entscheidend, dass das Seitenliniensystem zwischen externen (exafferenten) und selbst erzeugten (reafferenten) Strömungsreizen unterscheidet. Eine Folgeentladung schwächt selbst erzeugte Strömungssignale während der Fortbewegung bei Zebrafischen ab. Dieses hemmende prädiktive motorische Signal wird über absteigende Neuronen an die sensorischen Rezeptoren weitergeleitet, um den Eingang zu modifizieren oder die Verarbeitung des reafferenten Feedbacks zu unterbrechen28,29. Bahnbrechende Arbeiten, die zu unserem frühen Verständnis dieses Feedforward-Systems beitrugen, stützten sich auf In-vitro-Präparate, bei denen die Konnektivität und die endogene Aktivität des neuronalen Schaltkreises nicht aufrechterhalten wurden28,30,31,32,33,34,35. Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Erhaltung eines intakten neuronalen Schaltkreises, in dem die endogene Rückkopplungsdynamik aufrechterhalten wird, wodurch ein besseres Verständnis der Folgeentladung in vivo ermöglicht wird.
Das hier beschriebene Protokoll beschreibt, wie die Aktivität von afferenten Neuronen und Motoneuronen in Larvenzebrafischen gleichzeitig überwacht werden kann. Die Charakterisierung der afferenten Signaldynamik vor, während und nach motorischen Befehlen liefert Einblicke in die endogene Rückkopplung des zentralen Nervensystems in Echtzeit, die die Empfindlichkeit der Haarzellen während der Fortbewegung moduliert. Dieses Protokoll beschreibt, welche Materialien vor Experimenten vorbereitet werden müssen und beschreibt dann, wie Zebrafischlarven gelähmt und vorbereitet werden können. Das Protokoll wird beschreiben, wie eine stabile lose Patch-Aufzeichnung von afferenten Neuronen und extrazellulären ventralen Wurzelaufnahmen (VR) von Motoneuronen erstellt werden kann. Repräsentative Daten, die mit diesem Protokoll gewonnen werden können, werden von einer beispielhaften Person präsentiert und die Analyse wurde an mehreren Replikaten des experimentellen Protokolls durchgeführt. Die Vorverarbeitung der Daten erfolgt mithilfe von benutzerdefinierten Skripten in MATLAB. Insgesamt ist dieses experimentelle In-vivo-Paradigma bereit, ein besseres Verständnis des sensorischen Feedbacks während der Fortbewegung in einem Modell-Wirbeltier-Haarzellsystem zu liefern.
Das beschriebene experimentelle Protokoll bietet das Potenzial, endogene Veränderungen des sensorischen Inputs über motorisches Verhalten in einem intakten, sich verhaltenden Wirbeltier zu überwachen. Insbesondere beschreibt es einen In-vivo-Ansatz zur Durchführung simultaner extrazellulärer Aufnahmen von lateralen line afferenten Neuronen und ventralen motorischen Wurzeln in Larvenzebrafischen. Spontane affente Aktivität wurde zuvor bei Zebrafischen ohne Berücksichtigung einer möglichen gleichzeitigen motorische…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken dem National Institute of Health (DC010809), der National Science Foundation (IOS1257150, 1856237) und dem Whitney Laboratory for Marine Biosciences für J.C.L. Wir danken ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Liao Lab für anregende Diskussionen.
100 mL beaker | PYREX | 1000 | resceptacle for etchant |
10x water immersion objective | Olympus | UMPLFLN10xW | low magnification for positioning larvae and recording electrode |
40x water immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp |
abfload.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files | |
AffVR_preprocess.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for preprocessing recording data | |
BNC coaxial cables | ThorLabs | 2249-C-12 | connecting amplifier and digitizer channels; require 4 |
borosilicate glass capillaries w/ filament | Warner Instruments | G150F-3 | inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes |
burst_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
computer | N/A | N/A | any computer should work |
DC Power Supply | Tenma | 72-420 | used for electrically etching dissection pins |
electrophysiology digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | enables acquisition of patch-clamp data |
filament | Sutter Instrument Company | FB255B | 2.5 mm box filament used in micropipette puller |
fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | used to manipulate larvae and insert pins |
fixed stage DIC microscope | Olympus | BX51WI | microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings |
flexible, tapered pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-169 | flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip |
FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | cover glass bottomed dish recording dish |
KimWipe | KimTech | 34155 | task wipe used for wicking away excess fluid from larvae |
Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | self-mixing sylgard elastomer |
MATLAB | MathWorks | R2020b | command line software for preprocessing data |
microelectrode amplifier | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplifier for dual channel recordings |
microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish recording electrode |
micromanipulator control unit | Siskiyou | MC1000-eR/T | 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator |
micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | for pulling capillary glass into recording electrodes |
microscope control unit | Siskiyou | MC1000e | positions the microscope around the fixed stage and preparation |
motorized micromanipulator | Siskiyou | MX7600 | positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording |
MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page |
optical air table | Newport Corporation | VH3036W-OPT | breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings |
pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page |
permanent ink marker | Sharpie | order from amazon.com | for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder |
petri-dish | Falcon | 35-3001 | used to immerse larvae in paralytic |
pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | hold recording electrode and connect to the headstage |
pneumatic transducer | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | for controlling recording electrode internal pressure |
potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473-25G | etchant for etching dissection pins |
silicone tubing | Tygon | 14-169-1A | tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder |
spike_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | used to visualize pin tips and during preparation of larvae |
straight edge razor blade | Canopus | order from amazon.com | cuts the tungsten wire while making dissection pins |
swimbout_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
syringe | Becton Dickinson Compoany | 309602 | filled with extracellular solution to inject into recording electrodes |
transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | single use, non-sterile pipette for transfering larvae |
tricaine methanesulfonate | Syndel | 12854 | pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage. |
tungsten wire | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins |
vacuum filtration unit | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer |
voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages |
α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | for immobilizing the larvae prior to recording |