Vi beskriver en protokoll for å overvåke endringer i den afferente nevronaktiviteten under motorkommandoer i et modell virveldyrhårcellesystem.
Sensoriske systemer samler signaler som er avgjørende for å styre atferd, men dyr må tyde hvilken informasjon som er biologisk relevant. Locomotion genererer reafferent signaler om at dyr må disentangle fra relevante sensoriske signaler i omgivelsene. For eksempel, når en fisk svømmer, oppdages strømning generert fra kroppsunduleringer av mekanoreceptive nevromasser, som består av hårceller, som komponerer sidelinjen. Hårcellene overfører deretter væskebevegelsesinformasjon fra sensoren til hjernen via de sensoriske afferente nevronene. Samtidig sendes korollær utladning av motorkommandoen til hårceller for å forhindre sensorisk overbelastning. Å ta hensyn til den hemmende effekten av prediktive motorsignaler under bevegelse er derfor kritisk når man vurderer følsomheten til sidelinjesystemet. Vi har utviklet en in vivo elektrofysiologisk tilnærming for samtidig å overvåke bakre lateral linje afferent neuron og ventral motorrotaktivitet i sebrafisk larver (4-7 dager etter befruktning) som kan vare i flere timer. Ekstracellulære opptak av afferente nevroner oppnås ved hjelp av den løse patchklemmeteknikken, som kan oppdage aktivitet fra enkle eller flere nevroner. Ventrale rotopptak utføres gjennom huden med glasselektroder for å oppdage motorisk nevronaktivitet. Vår eksperimentelle protokoll gir potensial til å overvåke endogene eller fremkalte endringer i sensorisk inngang på tvers av motorisk atferd i en intakt, oppførende virveldyr.
Afferent nevroner av mekanosensoriske systemer overfører informasjon fra hårceller til hjernen under hørsel og balanse. Elektrofysiologi kan avsløre følsomheten til afferente nevroner gjennom direkte opptak. Selv om det kan være utfordrende å lappe hele celler fra hårceller, er det enklere å registrere fra nedstrøms afferente nevroner og tillater vurdering av handlingspotensialer som svar på kontrollerte stimuleringer1,2,3. Stimulerende hårceller fører til avbøyning, som endrer mekanosensoriske strukturer, og utløser dermed en økning i virkningspotensialer (pigger) i afferent nevroner4,5,6. I fravær av ytre stimuli øker afferente nevroner også spontant på grunn av glutamatlekkasje fra hårcellene til afferent postsynaptiske terminaler7,8, og har vist seg å bidra til å opprettholde følsomhet9,10. Patch klemme registrering av afferent aktivitet muliggjør observasjon av hårcelle følsomhet og signaldynamikk som ikke er mulig ved hjelp av teknikker med lavere temporal oppløsning, for eksempel i mikrofonikk11,12 eller funksjonell kalsiumavbildning13,14,15. Følgende protokoll vil tillate opptak av afferent aktivitet samtidig med motorkommandoer for å avsløre øyeblikkelige endringer i hårcellefølsomhet.
Sebrafisk (Danio rerio) bruker hårceller som finnes i nevromasser som komponerer laterallinjesystemet for å oppdage vannbevegelse i forhold til kroppen, som oversettes til nevrale signaler som er avgjørende fornavigasjon 16,17,18, rovdyrunngåelse, byttedyr fange19,20og skolegang21. Vannstrømmen kan også selvgenereres av bevegelsene til svømming22,23,24, åndedrett22,25,26og fôring27. Disse atferdene består av repeterende bevegelser som kan tretthet hårceller og svekke sensing. Derfor er det kritisk at sidelinjen systemet skiller mellom ekstern (exafferent) og selvgenerert (reafferent) strømning stimuli. En korollær utslipp demper selvgenererte strømningssignaler under bevegelse i sebrafisk. Dette hemmende prediktive motorsignalet videresendes via synkende nevroner til sensoriske reseptorer for å endre inngangen eller avbryte behandlingen av den reafferente tilbakemeldingen28,29. Seminalarbeid som bidro til vår tidlige forståelse av dette feedforward-systemet, stolte på in vitro-preparater der tilkoblings- og endogene aktiviteten til nevralkretsen ikke ble opprettholdt28,30,31,32,33,34,35. Denne protokollen beskriver en tilnærming til å bevare en intakt nevral krets der endogen tilbakemeldingsdynamikk opprettholdes og dermed muliggjør bedre forståelse av korollær utslipp in vivo.
Protokollen som er skissert her beskriver hvordan man overvåker bakre laterallinje afferent neuron og motorisk nevronaktivitet samtidig i larval sebrafisk. Karakterisering av afferent signaldynamikk før, under og etter motoriske kommandoer gir innsikt i sanntid, endogen tilbakemelding fra sentralnervesystemet som modulerer hårcellefølsomhet under bevegelse. Denne protokollen skisserer hvilke materialer som må utarbeides før eksperimenter, og beskriver deretter hvordan man lammer og forbereder sebrafisk larver. Protokollen vil beskrive hvordan man etablerer en stabil løs patch opptak av afferent nevroner og ekstracellulær ventral rot (VR) opptak av motoriske nevroner. Representative data som kan fås ved hjelp av denne protokollen presenteres fra en eksemplarisk person og analyse ble utført på flere replikeringer av den eksperimentelle protokollen. Forhåndsbehandling av data utføres ved hjelp av tilpassede skriftlige skript i MATLAB. Totalt sett er dette in vivo eksperimentelle paradigmet klar til å gi en bedre forståelse av sensorisk tilbakemelding under bevegelse i et modell vertebrathårcellesystem.
Den eksperimentelle protokollen som er beskrevet, gir potensial til å overvåke endogene endringer i sensorisk inngang på tvers av motorisk atferd i en intakt, oppførende virveldyr. Spesielt beskriver den en in vivo-tilnærming til å utføre samtidige ekstracellulære opptak av laterale linje afferent nevroner og ventrale motorrøtter i larval sebrafisk. Spontan afferent aktivitet har tidligere vært preget av sebrafisk uten hensyn til potensiell samtidig motoraktivitet1,<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner takknemlig støtte fra National Institute of Health (DC010809), National Science Foundation (IOS1257150, 1856237) og Whitney Laboratory for Marine Biosciences til J.C.L. Vi vil takke tidligere og nåværende medlemmer av Liao Lab for å stimulere til diskusjoner.
100 mL beaker | PYREX | 1000 | resceptacle for etchant |
10x water immersion objective | Olympus | UMPLFLN10xW | low magnification for positioning larvae and recording electrode |
40x water immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp |
abfload.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files | |
AffVR_preprocess.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for preprocessing recording data | |
BNC coaxial cables | ThorLabs | 2249-C-12 | connecting amplifier and digitizer channels; require 4 |
borosilicate glass capillaries w/ filament | Warner Instruments | G150F-3 | inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes |
burst_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
computer | N/A | N/A | any computer should work |
DC Power Supply | Tenma | 72-420 | used for electrically etching dissection pins |
electrophysiology digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | enables acquisition of patch-clamp data |
filament | Sutter Instrument Company | FB255B | 2.5 mm box filament used in micropipette puller |
fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | used to manipulate larvae and insert pins |
fixed stage DIC microscope | Olympus | BX51WI | microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings |
flexible, tapered pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-169 | flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip |
FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | cover glass bottomed dish recording dish |
KimWipe | KimTech | 34155 | task wipe used for wicking away excess fluid from larvae |
Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | self-mixing sylgard elastomer |
MATLAB | MathWorks | R2020b | command line software for preprocessing data |
microelectrode amplifier | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplifier for dual channel recordings |
microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish recording electrode |
micromanipulator control unit | Siskiyou | MC1000-eR/T | 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator |
micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | for pulling capillary glass into recording electrodes |
microscope control unit | Siskiyou | MC1000e | positions the microscope around the fixed stage and preparation |
motorized micromanipulator | Siskiyou | MX7600 | positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording |
MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page |
optical air table | Newport Corporation | VH3036W-OPT | breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings |
pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page |
permanent ink marker | Sharpie | order from amazon.com | for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder |
petri-dish | Falcon | 35-3001 | used to immerse larvae in paralytic |
pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | hold recording electrode and connect to the headstage |
pneumatic transducer | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | for controlling recording electrode internal pressure |
potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473-25G | etchant for etching dissection pins |
silicone tubing | Tygon | 14-169-1A | tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder |
spike_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | used to visualize pin tips and during preparation of larvae |
straight edge razor blade | Canopus | order from amazon.com | cuts the tungsten wire while making dissection pins |
swimbout_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
syringe | Becton Dickinson Compoany | 309602 | filled with extracellular solution to inject into recording electrodes |
transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | single use, non-sterile pipette for transfering larvae |
tricaine methanesulfonate | Syndel | 12854 | pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage. |
tungsten wire | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins |
vacuum filtration unit | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer |
voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages |
α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | for immobilizing the larvae prior to recording |