Скрининг на основе фрагментов с помощью ЯМР является надежным методом быстрой идентификации низкомолекулярных связывающих веществ с биомакромолекулами (ДНК, РНК или белками). Представлены протоколы, описывающие автоматическую пробоподготовку, эксперименты ЯМР и условия сбора данных, а также рабочие процессы анализа. Этот метод позволяет оптимально использовать как 1H, так и 19F ЯМР-активных ядер для обнаружения.
Скрининг на основе фрагментов (FBS) является хорошо проверенной и общепринятой концепцией в процессе открытия лекарств как в академических кругах, так и в промышленности. Самым большим преимуществом скрининга фрагментов на основе ЯМР является его способность не только обнаруживать связующие вещества со сродством более 7-8 порядков, но и контролировать чистоту и химическое качество фрагментов и, таким образом, производить высококачественные попадания и минимальное количество ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Предварительным условием в FBS является выполнение начального и периодического контроля качества библиотеки фрагментов, определение растворимости и химической целостности фрагментов в соответствующих буферах и создание нескольких библиотек для покрытия различных каркасов для размещения различных классов мишеней макромолекул (белки/РНК/ДНК). Кроме того, требуется обширная оптимизация протокола скрининга на основе ЯМР в отношении количества образцов, скорости сбора и анализа на уровне биологического конструкта / фрагментного пространства, в пространстве условий (буфер, добавки, ионы, pH и температура) и в лигандном пространстве (аналоги лигандов, концентрация лигандов). По крайней мере, в академических кругах эти усилия по скринингу до сих пор предпринимались вручную в очень ограниченном объеме, что приводило к ограниченной доступности инфраструктуры скрининга не только в процессе разработки лекарств, но и в контексте разработки химических зондов. Для того, чтобы удовлетворить требования экономно, представлены расширенные рабочие процессы. Они используют преимущества новейшего современного оборудования, с помощью которого сбор жидких проб может быть заполнен в ЯМР-пробирки с регулируемой температурой в автоматическом режиме. 1Затем спектры на основе ЯМР-лигандов H/19F собираются при заданной температуре. Высокопроизводительный сменщик образцов (HT sample changer) может обрабатывать более 500 образцов в блоках с регулируемой температурой. Это вместе с передовыми программными инструментами ускоряет сбор и анализ данных. Кроме того, описано применение процедур скрининга на образцах белков и РНК, чтобы ознакомить с установленными протоколами для широкой пользовательской базы в биомакромолекулярных исследованиях.
Скрининг на основе фрагментов в настоящее время является широко используемым методом идентификации довольно простых и низкомолекулярных молекул (MW <250 Da), которые демонстрируют слабое связывание с макромолекулярными мишенями, включая белки, ДНК и РНК. Первоначальные попадания с первичных экранов служат основой для проведения вторичного скрининга коммерчески доступных более крупных аналогов попаданий, а затем для использования стратегий роста фрагментов или связывания на основе химии. Для успешной платформы обнаружения лекарств на основе фрагментов (FBDD), как правило, требуется надежный биофизический метод для обнаружения и характеристики слабых попаданий, библиотека фрагментов, биомолекулярная мишень и стратегия последующей химии. Четырьмя широко применяемыми биофизическими методами в рамках кампаний по открытию лекарств являются анализы теплового сдвига, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), кристаллография и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
ЯМР-спектроскопия показала различные роли на разных этапах FBDD. Помимо обеспечения химической чистоты и растворимости фрагментов в библиотеке фрагментов, растворенных в оптимизированной буферной системе, эксперименты с ЯМР, наблюдаемые лигандом, могут обнаруживать связывание фрагмента с мишенью с низким сродством, а эксперименты с ЯМР-мишенью могут очертить эпитоп связывания фрагмента, что позволяет проводить детальные исследования взаимосвязи между структурой и активностью. В рамках эпитопного картирования изменения химического сдвига на основе ЯМР не только идентифицируют ортостерические сайты связывания, но и аллостерические сайты, которые могут быть загадочными и доступными только в так называемых возбужденных конформационных состояниях биомолекулярной мишени. Если биомолекулярная мишень уже связывает эндогенный лиганд, идентифицированные фрагментные попадания можно легко классифицировать как аллостерические или ортостерические, проводя конкурентные эксперименты на основе ЯМР. Определение константы диссоциации (KD) взаимодействия лиганд-мишень является важным аспектом в процессе FBDD. Химическое титрование на основе ЯМР, как лиганда, так и мишени, может быть легко выполнено для определения KD. Основным преимуществом ЯМР является то, что исследования взаимодействия проводятся в растворе и близких к физиологическим условиям. Таким образом, все конформационные состояния для анализа взаимодействия лиганда/фрагмента с мишенью могут быть исследованы. Кроме того, подходы, основанные на ЯМР, не только ограничены скринингом хорошо свернутых растворимых белков, но также применяются для размещения большего целевого пространства, включая ДНК, РНК, связанные с мембраной и внутренне неупорядоченные белки1.
Библиотеки фрагментов являются неотъемлемой частью процесса FBDD. Как правило, фрагменты действуют как начальные предшественники, которые в конечном итоге становятся частью (субструктурой) нового ингибитора, разработанного для биологической мишени. Сообщалось, что несколько препаратов (Венетоклакс2, Вемурафениб3, Эрдафитиниб4, Пексидартниб5) начинались как фрагменты и в настоящее время успешно используются в клиниках. Как правило, фрагменты представляют собой низкомолекулярные (<250 Да) органические молекулы с высокой растворимостью и стабильностью в воде. Тщательно продуманная библиотека фрагментов, содержащая, как правило, несколько сотен фрагментов, уже может обещать эффективное исследование химического пространства. Общий состав библиотек фрагментов развивался со временем и чаще всего получался путем рассечения известных лекарств на более мелкие фрагменты или разрабатывался вычислительно. Эти разнообразные библиотеки фрагментов в основном содержат плоские ароматические или гетероатомы и придерживаются правила Липински 5 6 или текущего коммерческого тренда правила 3 7, но избегают реакционноспособных групп. Некоторые библиотеки фрагментов также были получены или состояли из хорошо растворимых метаболитов, натуральных продуктов и/или их производных8. Общая проблема, возникающая в большинстве библиотек фрагментов, заключается в простоте последующей химии.
Центр биомолекулярного магнитного резонанса (BMRZ) при Университете Гёте во Франкфурте является партнером iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), консорциума структурных исследовательских инфраструктур для всех европейских исследователей из всех областей биохимических и биомедицинских исследований. В рамках предыдущей инициативы iNEXT, которая завершилась в 2019 году, была создана библиотека фрагментов, состоящая из 768 фрагментов, с целью «минимального количества фрагментов и максимального разнообразия», охватывающего большое химическое пространство. Кроме того, в отличие от любой другой библиотеки фрагментов, библиотека фрагментов iNEXT также была разработана на основе концепции «уравновешенных фрагментов» с целью облегчения последующего синтеза сложных лигандов с высоким сродством и отныне известна как внутренняя библиотека (Diamond, Structural Genomic Consortium и iNEXT).
Создание FBDD с помощью ЯМР требует рабочей силы, знаний и инструментов. На БМРЗ были разработаны оптимизированные рабочие процессы для поддержки технической помощи в скрининге фрагментов с помощью ЯМР. К ним относятся контроль качества и оценка растворимости библиотеки фрагментов 9, оптимизация буфера для выбранных мишеней, скрининг на основе 1D-лиганда, наблюдаемый 1H или 19F, конкурентные эксперименты по дифференциации ортостерического и аллостерического связывания, эксперименты по ЯМР-наблюдению за мишенями на основе 2D для картирования эпитопов и для характеристики взаимодействия со вторичным набором производных исходных попаданий фрагментов. BMRZ установил автоматизированные процедуры для анализа, как также обсуждалось ранее в литературе 10,11, низкомолекулярных и белковых взаимодействий и имеет всю необходимую автоматизированную инфраструктуру для скрининга фрагментов на основе ЯМР. В нем реализованы ЯМР с переносом насыщения (STD-ЯМР), водный лиганд, наблюдаемый с помощью градиентной спектроскопии (waterLOGSY), и релаксационные эксперименты на основе Карра-Перселла-Мейбума-Гилла (на основе CPMG) для идентификации фрагментов в широком диапазоне режимов сродства, а также современные автоматизированные приборы и программное обеспечение ЯМР для открытия лекарств. В то время как скрининг фрагментов на основе ЯМР хорошо зарекомендовал себя для белков, этот подход реже используется для поиска новых лигандов, взаимодействующих с РНК и ДНК. BMRZ доказал концепцию новых протоколов, позволяющих идентифицировать взаимодействия малых молекул РНК / ДНК. В следующих разделах этого вклада сообщается, что применение процедур скрининга на образцах белков и РНК позволяет узнать об установленных протоколах для широкой базы пользователей в биомакромолекулярных исследованиях.
Универсальность скрининга фрагментов/лекарств на основе ЯМР. BMRZ успешно внедрил самые современные автоматизированные приборы ЯМР, а также эксперименты по ЗППП-ЯМР, waterLOGSY и релаксации для идентификации фрагментов в широком диапазоне аффинного режима для открытия лекарств. Установленное оборудование включает в себя высокопроизводительный робот для подготовки образцов и высокопроизводительный блок хранения, смены и сбора данных, связанный со спектрометром 600 МГц. Недавно приобретенный криогенный зонд для 1 H, 19 F, 13 C и 15N обеспечивает требуемую чувствительность для предлагаемых измерений и позволяет разъединять 1 H (1) во время обнаружения 19F. Этот датчик подключен к консоли ЯМР последнего поколения, которая дает возможность использовать передовые программные инструменты Bruker, включая CMC-q, CMC-assist, CMC-se и FBS (входит в состав TopSpin). Инструмент скрининга на основе фрагментов (FBS) включен в последнюю версию TopSpin и помогает анализировать высокопроизводительные данные, включающие эксперименты STD, waterLOGSY, T2 / T1 r-релаксации. Жидкостный пробоотборник 1D 1H может быть заполнен в ЯМР-пробирки автоматическим способом с помощью робота для наполнения проб. Как правило, блок из 96 трубок (3 мм) заполняется примерно за два часа. 96-луночные пластинчатые стойки непосредственно расположены в устройстве смены образцов HT, которое считывает штрих-код блока и назначает ЯМР-трубки для экспериментов, контролируемых программным обеспечением автоматизации (IconNMR). Пять 96-луночных пластинчатых стеллажей могут храниться и программироваться в устройстве смены образцов HT одновременно. Температуру каждой из отдельных стоек можно контролировать и регулировать отдельно. Кроме того, каждый отдельный образец может быть предварительно подготовлен (предварительный нагрев и сушка в пробирке для удаления конденсированной влаги) до желаемой температуры перед измерением.
Пригодность для широкого спектра применений. Одним из широких применений этого автоматизированного скрининга на основе ЯМР является идентификация и разработка новых лигандов, связывающихся с биомакромолекулярной мишенью (ДНК / РНК / белки). Эти лиганды могут включать ортостерические и аллостерические ингибиторы, которые обычно связываются нековалентно. Кроме того, FBDD с помощью ЯМР обычно используется в качестве первого шага для выбора перспективных соединений, требования, которые должны быть выполнены, – это наличие биомолекулярной мишени в достаточных количествах. Эта цель подразделяется на две основные задачи.
Первая задача состоит в том, чтобы разработать и охарактеризовать собственную библиотеку фрагментов по следующим причинам: начальный и периодический контроль качества, характеристика и количественная оценка более 1000 фрагментов; определение растворимости фрагментов в буферах, оптимизированных для каждой мишени, в частности для белковых мишеней; и создание нескольких библиотек для размещения различных каркасов и распространения на другие классы макромолекул. Вторая задача состоит в том, чтобы интегрировать рабочие процессы для разработки лекарств на основе фрагментов (FBDD) с помощью ЯМР с использованием: автоматизированного скрининга под наблюдением 1D-лиганда (1H и 19F); автоматизированные замещающие анализы (конкурентные эксперименты с (природным) лигандом) для дифференциации ортостерического и аллостерического связывания; автоматизированные вторичные скрининги с несколькими фрагментами; автоматизированный скрининг 2D-белков и вторичный скрининг набора производных вокруг начального попадания с использованием библиотеки EU-OPENSCREEN или любой другой библиотеки; и повторное профилирование скрининга библиотеки FDA в соответствии с выбранными целевыми показателями.
Кроме того, метаботипирование различных клеточных линий (связанных с заболеванием) может быть проведено для того, чтобы разгадать регуляторные механизмы, которые связывают контроль клеточного цикла и метаболизм. Кроме того, существует функциональная характеристика элементов регуляции РНК/ДНК/белка in vivo и in vitro для оптимизации конструкции / оптимизации домена (оптимизация стабильности для структурных исследований (скрининг буфера, pH, температуры и соли) и расширение скрининга фрагментов на основе ЯМР на мембранные белки и внутренне неупорядоченные белки, которые, как правило, недоступны для других методов.
Ограничения. Использование библиотек фрагментов 19F и 1H имеет свои плюсы и минусы, некоторые из которых будут упомянуты ниже. Самым большим преимуществом измерений 19F по сравнению с 1H является скорость как фактического времени измерения, так и последующего анализа, поскольку смеси содержат почти вдвое больше фрагментов и необходимо проводить меньше экспериментов. Последующий анализ также проще для скрининга 19F, поскольку нет помех от буферов и, кроме того, предлагается более широкий диапазон химического сдвига практически без перекрытия сигналов для оптимально спроектированной смеси фрагментов. Сами спектры значительно упрощены, обычно имеют только один или два сигнала на фрагмент, в зависимости от количества атомов фтора. Таким образом, анализ этих спектров может быть автоматизирован, что опять же сокращает время. Это происходит за счет химического разнообразия, по крайней мере, для библиотеки, используемой в этом исследовании. Поскольку только ~ 13% библиотеки содержит 19 F, но, естественно, все они могут быть использованы при скрининге 1H, разнообразие фрагментов скрининга 19F будет ниже. Это можно было бы обойти, используя специально разработанные библиотеки 19F с большим количеством фрагментов и большим химическим разнообразием. Еще одним недостатком экранирования 19F является малое количество сигналов на фрагмент. Фрагменты обычно состоят из более чем одного атома водорода. Таким образом, экспериментыпо скринингу 1 H могут полагаться на разные сигналы для одного и того же фрагмента для обнаружения связывания. Это дает более высокую степень достоверности при идентификации попаданий для скрининга 1H, тогда как скрининг 19F должен полагаться на один или два сигнала, подаваемых на фрагмент.
Представлен подробный отчет о современных автоматизированных приборах скрининга фрагментов на основе ЯМР, программном обеспечении и методах и протоколах их анализа. Установленное оборудование включает в себя высокопроизводительного робота-пробоподготовки и высокопроизводительный блок хранения, смены и сбора данных, связанный со спектрометром 600 МГц. Недавно установленная криогенная зондовая головка для 1 H, 19 F, 13C и 15 N обеспечивает требуемую чувствительность для предлагаемых измерений и позволяет развязывать 1H во время обнаружения 19F. Кроме того, последнее поколение консоли ЯМР предлагает возможность использовать передовое аналитическое программное обеспечение для облегчения сбора данных и анализа на лету. Рассмотренная выше технология, рабочие процессы и описанные протоколы должны способствовать значительному успеху пользователей, использующих FBS с помощью ЯМР.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана iNEXT-Discovery, проект No 871037, финансируемый программой Horizon 2020 Европейской комиссии.
Bruker Avance III HD | Bruker | 600 MHz NMR Spectrometer | |
Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes | 3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK | ThermoFisher Scientific | Barcoded Tubes |
Matrix SepraSeal und DuraSeal& | 4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS | ThermoFisher Scientific | |
SampleJet | Bruker | HT Sample Changer | |
SamplePro Tube | Bruker | Pipetting Robot |