인간 만능 줄기 세포에서 망막 오가노이드의 지시 유도
Summary
자기 조직화 방법을 사용하여 광 수용체의 생성을 크게 증가시킬 수있는 COCO를 첨가 한 프로토콜을 개발합니다.
Abstract
망막 세포 이식은 망막 구조를 복원하고 퇴화 된 망막의 시각 능력을 안정화 시키거나 향상시킬 수있는 유망한 치료 접근법입니다. 그럼에도 불구하고 세포 대체 요법의 발전은 현재 고품질의 표준화 된 인간 망막의 기성품 공급원을 요구하는 문제에 직면 해 있습니다. 따라서 실험을 위해서는 쉽고 안정적인 프로토콜이 필요합니다. 여기에서 우리는 외인성 분자와 시약 A를 사용하는 자가 조직화 방법과 3차원 인간 망막 오가노이드(RO)를 생성하기 위한 수동 절제를 기반으로 최적화된 프로토콜을 개발합니다. 인간 만능 줄기 세포 (PSC) 유래 RO는 광 수용체에 대한 특정 마커를 발현합니다. 다기능 길항제 인 COCO를 첨가하면 광 수용체 전구체 및 원뿔의 분화 효율이 크게 증가합니다. 세포주와 일차 세포의 이점이 있고 후자와 관련된 소싱 문제 없이 이 시스템을 효율적으로 사용하면 합류성 망막 세포, 특히 광수용체를 생성할 수 있습니다. 따라서, RO로의 PSC의 분화는 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 세포 이식을 위한 최적의 생체관련성 플랫폼을 제공한다.
Introduction
만능 줄기 세포 (PSC)는자가 재생과 모든 종류의 체세포로 분화하는 능력이 특징입니다. 따라서 PSC에서 파생된 오가노이드는 재생 의학 연구에서 중요한 자원이 되었습니다. 망막 변성은 광 수용체 (막대 및 원뿔)와 망막 색소 상피의 손실을 특징으로합니다. 망막 세포 대체는이 질병에 대한 고무적인 치료법이 될 수 있습니다. 그러나 질병 연구 및 치료를 위해 인간 망막을 얻는 것은 불가능합니다. 따라서 다층 천연 망막 세포를 효과적이고 성공적으로 재현하는 PSC에서 파생된 망막 오가노이드(RO)는 기초 및 중개 연구에 유익합니다1,2,3. 우리의 연구는 망막 변성4를 연구하기에 충분하고 양질의 세포를 제공하기 위해 RO 분화에 중점을 둡니다.
RO를 차별화하는 방법은 2012 년 Sasai 실험실에서 개척 한 3 차원 (3D) 서스펜션 차별화와 함께 지속적으로 등장하고 있습니다5. 광수용체 전구체 세포를 특이적으로 추적하기 위해 인간 배아 줄기세포(hESC)에 CRX-tdTomato 태그를 도입하고 Wnt, TGF-β 및 BMP 경로6의 다기능 길항제인 COCO를 추가하여 방법을 수정했습니다. COCO는 광수용체 전구체 및 원뿔 6,7의 분화 효율을 효율적으로 향상시키는 것으로 나타났습니다.
전체적으로 고전적인 분화 방법을 수정함으로써 실험실 조사를 통해 광 수용체와 관련된 망막 질환을 분석하고 추가 임상 적용 / 이식을 위해 인간 RO에서 풍부한 광 수용체 전구체 및 원뿔을 수확하는 접근 가능한 프로토콜을 개발했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
망막 오가노이드 분화는 충분한 기능성 망막 세포의 생성을 위한 바람직한 방법이다. RO는 신경절 세포, 양극성 세포 및 광 수용체와 같은 다양한 망막 세포의 복합체로, 신경 망막 4,5,8,9쪽으로 다 능성 줄기 세포에 의해 생성됩니다. 합류 RO를 수확할 수 있지만 시간이 많이 걸리므로 긴 배양 기간(최?…
Acknowledgements
원고에 대한 기술 지원과 유용한 의견을 주신 502 연구소 회원들에게 감사드립니다. 이 연구는 Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014)과 National Key R & D Program of China (2017YFA0105300)의 지원을 부분적으로 받았습니다.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo – Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
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