İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Retinal Organoidlerin Yönlendirilmiş İndüksiyonu
Summary
Kendi kendini organize eden bir yöntem kullanarak, fotoreseptörlerin oluşumunu önemli ölçüde artırabilecek COCO ilavesiyle bir protokol geliştiriyoruz.
Abstract
Retina hücre transplantasyonu, retina mimarisini geri yükleyebilen ve dejenere olmuş retinanın görsel yeteneklerini stabilize edebilen veya hatta geliştirebilen umut verici bir terapötik yaklaşımdır. Bununla birlikte, hücre replasman tedavisindeki ilerleme, şu anda yüksek kaliteli ve standartlaştırılmış insan retinalarının hazır bir kaynağına ihtiyaç duymanın zorluklarıyla karşı karşıyadır. Bu nedenle, deneyler için kolay ve kararlı bir protokole ihtiyaç vardır. Burada, eksojen moleküllerin ve reaktif A’nın yanı sıra üç boyutlu insan retina organoidlerini (RO) üretmek için manuel eksizyonun kullanıldığı kendi kendini organize eden bir yönteme dayanan optimize edilmiş bir protokol geliştiriyoruz. İnsan Pluripotent Kök Hücreleri (PSC’ler) kaynaklı RO, fotoreseptörler için spesifik belirteçleri ifade eder. Çok fonksiyonlu bir antagonist olan COCO’nun eklenmesiyle, fotoreseptör öncüllerinin ve konilerinin farklılaşma etkinliği önemli ölçüde artar. Hücre hatlarının ve birincil hücrelerin faydalarına sahip olan ve ikincisiyle ilişkili kaynak sorunları olmadan bu sistemin verimli kullanımı, özellikle fotoreseptörler olmak üzere akan retinal hücreler üretebilir. Bu nedenle, PSC’lerin RO’ya farklılaşması, hastalık modellemesi, ilaç taraması ve hücre nakli için optimal ve biyoilgili bir platform sağlar.
Introduction
Pluripotent kök hücreler (PSC’ler), kendilerini yenilemeleri ve her türlü somatik hücreye farklılaşma yetenekleri ile karakterize edilir. Böylece, PSC’lerden türetilen organoidler, rejeneratif tıp araştırmalarında önemli bir kaynak haline gelmiştir. Retina dejenerasyonu, fotoreseptörlerin (çubuklar ve koniler) ve retinal pigment epitelinin kaybı ile karakterizedir. Retinal hücre replasmanı bu hastalık için cesaret verici bir tedavi olabilir. Bununla birlikte, hastalık araştırması ve tedavisi için insan retinası elde etmek mümkün değildir. Bu nedenle, çok katmanlı doğal retina hücrelerini etkili ve başarılı bir şekilde özetleyen PSC’lerden türetilen retinal organoidler (RO’lar), temel ve translasyonel araştırmalar için faydalıdır 1,2,3. Araştırmamız, retinal dejenerasyonu incelemek için yeterli ve kaliteli hücreler sağlamak için RO farklılaşmasına odaklanmaktadır4.
RO’ları farklılaştırma yöntemleri, 2012 yılında Sasai laboratuvarı tarafından öncülük edilen üç boyutlu (3D) süspansiyon farklılaşması ile sürekli olarak ortaya çıkmaktadır5. Fotoreseptör öncü hücrelerini özel olarak izlemek için insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC’ler) CRX-tdDomates etiketini tanıttık ve Wnt, TGF-β ve BMP yollarının6 çok işlevli bir antagonisti olan COCO’nun eklenmesiyle yöntemi değiştirdik. COCO’nun fotoreseptör öncüllerinin ve konilerinin farklılaşma verimliliğini etkili bir şekilde arttırdığı gösterilmiştir 6,7.
Toplamda, klasik farklılaşma yöntemini değiştirerek, laboratuvar araştırmaları yoluyla fotoreseptörlerle ilişkili retina hastalığını analiz etmek ve daha ileri klinik uygulama / transplantasyon için insan RO’larından bol miktarda fotoreseptör öncülleri ve konileri toplamak için erişilebilir bir protokol geliştirdik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retinal organoid farklılaşması, bol fonksiyonel retina hücrelerinin oluşumu için arzu edilen bir yöntemdir. RO, pluripotent kök hücreler tarafından nöral retinaya doğru üretilen gangliyon hücreleri, bipolar hücreler ve fotoreseptörler gibi farklı retinal hücrelerin bir bileşimidir 4,5,8,9. Akıcı RO’lar hasat edilebilse de, uzun kültürleme süreleri (180 güne kadar) gerek…
Acknowledgements
502 laboratuvarı üyelerine makaleyle ilgili teknik destekleri ve yararlı yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Pekin Belediyesi Doğa Bilimleri Vakfı (Z200014) ve Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2017YFA0105300) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo – Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
- Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).
- Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
- Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
- Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).
- Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286 (2015).
