Направленная индукция органоидов сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека
Summary
Используя самоорганизующийся метод, мы разрабатываем протокол с добавлением COCO, который может значительно увеличить генерацию фоторецепторов.
Abstract
Трансплантация клеток сетчатки является перспективным терапевтическим подходом, который может восстановить архитектуру сетчатки и стабилизировать или даже улучшить зрительные возможности дегенерированной сетчатки. Тем не менее, прогресс в клеточной заместительной терапии в настоящее время сталкивается с проблемами, связанными с необходимостью использования готового источника высококачественной и стандартизированной сетчатки человека. Поэтому для экспериментов необходим простой и стабильный протокол. Здесь мы разрабатываем оптимизированный протокол, основанный на самоорганизующемся методе с использованием экзогенных молекул и реагента А, а также ручного иссечения для генерации трехмерных органоидов сетчатки человека (RO). Ro, полученный из плюрипотентных стволовых клеток человека (PSC), экспрессирует специфические маркеры для фоторецепторов. С добавлением КОКО, многофункционального антагониста, эффективность дифференцировки предшественников и колбочек фоторецепторов значительно повышается. Эффективное использование этой системы, которая имеет преимущества клеточных линий и первичных клеток, и без проблем с источниками, связанных с последними, может производить сливающиеся клетки сетчатки, особенно фоторецепторы. Таким образом, дифференциация PSC в RO обеспечивает оптимальную и биорелевантную платформу для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и трансплантации клеток.
Introduction
Плюрипотентные стволовые клетки (PSC) характеризуются их самообновлением и способностью дифференцироваться во все виды соматических клеток. Таким образом, органоиды, полученные из PSC, стали важным ресурсом в исследованиях регенеративной медицины. Дегенерация сетчатки характеризуется потерей фоторецепторов (палочек и колбочек) и пигментного эпителия сетчатки. Замена клеток сетчатки может быть обнадеживающим лечением этого заболевания. Тем не менее, невозможно получить сетчатку человека для исследования и терапии заболеваний. Таким образом, органоиды сетчатки (RO), полученные из PSC, которые эффективно и успешно рекапитулируют многослойные нативные клетки сетчатки, полезны для фундаментальных и трансляционных исследований 1,2,3. Наше исследование сосредоточено на дифференцировке РО для обеспечения достаточных и качественных клеток для изучения дегенерации сетчатки4.
Методы дифференциации РО постоянно появляются, с трехмерной (3D) дифференциацией суспензии, впервые предложенной лабораторией Sasai в 2012году 5. Мы ввели метку CRX-tdTomato в эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) для конкретного отслеживания клеток-предшественников фоторецепторов и модифицировали метод с добавлением COCO, многофункционального антагониста путей Wnt, TGF-β и BMP6. Было показано, что COCO эффективно повышает эффективность дифференцировки предшественников фоторецепторов и колбочек 6,7.
В целом, модифицируя классический метод дифференцировки, мы разработали доступный протокол для сбора обильных предшественников фоторецепторов и колбочек из ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ РО для анализа заболевания сетчатки, связанного с фоторецепторами, посредством лабораторных исследований и для дальнейшего клинического применения / трансплантации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Дифференцировка органоидов сетчатки является желательным методом для генерации достаточных функциональных клеток сетчатки. RO представляет собой композит различных клеток сетчатки, таких как ганглиозные клетки, биполярные клетки и фоторецепторы, генерируемые плюрипотентными ствол?…
Acknowledgements
Мы благодарим сотрудников лаборатории 502 за их техническую поддержку и полезные комментарии относительно рукописи. Эта работа была частично поддержана Пекинским муниципальным фондом естественных наук (Z200014) и Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2017YFA0105300).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo – Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
- Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).
- Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
- Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
- Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).
- Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286 (2015).
