Rettet induktion af retinale organoider fra humane pluripotente stamceller
Summary
Ved hjælp af en selvorganiserende metode udvikler vi en protokol med tilføjelse af COCO, der kan øge dannelsen af fotoreceptorer betydeligt.
Abstract
Retinal celletransplantation er en lovende terapeutisk tilgang, som kan genoprette retinal arkitekturen og stabilisere eller endda forbedre de visuelle evner til den degenererede nethinden. Ikke desto mindre står fremskridt inden for celleudskiftningsterapi i øjeblikket over for udfordringerne ved at kræve en hyldevare med høj kvalitet og standardiserede menneskelige nethinder. Derfor er der brug for en nem og stabil protokol til eksperimenterne. Her udvikler vi en optimeret protokol baseret på en selvorganiserende metode med brug af eksogene molekyler og reagens A samt manuel excision til at generere de tredimensionelle humane nethindeorganoider (RO). Den humane pluripotente stamceller (PSC’er) -afledte RO udtrykker specifikke markører for fotoreceptorer. Med tilsætningen af COCO, en multifunktionel antagonist, øges differentieringseffektiviteten af fotoreceptorprækursorer og kegler signifikant. Den effektive anvendelse af dette system, som har fordelene ved cellelinjer og primære celler, og uden de indkøbsproblemer, der er forbundet med sidstnævnte, kunne producere sammenflydende retinale celler, især fotoreceptorer. Differentieringen af kvikskranker til RO giver således en optimal og biorelevant platform for sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og celletransplantation.
Introduction
Pluripotente stamceller (PSC’er) er kendetegnet ved deres selvfornyelse og evne til at differentiere sig i alle slags somatiske celler. Således er organoider afledt af PSC’er blevet en vigtig ressource inden for forskning i regenerativ medicin. Retinal degeneration er kendetegnet ved tab af fotoreceptorer (stænger og kegler) og retinal pigmentepitel. Udskiftning af retinale celler kan være en opmuntrende behandling af denne sygdom. Det er imidlertid ikke muligt at få humane nethinder til sygdomsforskning og -behandling. Derfor er retinale organoider (RO’er) afledt af PSC’er, som effektivt og med succes rekapitulerer flerlags native retinale celler, gavnlige for grundlæggende og translationel forskning 1,2,3. Vores forskning fokuserer på RO-differentiering for at give tilstrækkelige celler af høj kvalitet til at studere retinal degeneration4.
Metoder til differentiering af RO’er dukker løbende op med tredimensionel (3D) suspensionsdifferentiering, der blev banebrydende af Sasai-laboratoriet i 20125. Vi introducerede CRX-tdTomato-mærket i de humane embryonale stamceller (hESC’er) for specifikt at spore fotoreceptorforløbercellerne og ændrede metoden med tilføjelsen af COCO, en multifunktionel antagonist af Wnt-, TGF-β- og BMP-veje6. COCO har vist sig effektivt at forbedre differentieringseffektiviteten af fotoreceptorprækursorer og kegler 6,7.
Alt i alt har vi ved at ændre den klassiske differentieringsmetode udviklet en tilgængelig protokol til at høste rigelige fotoreceptorforstadier og kegler fra humane RO’er til analyse af nethindesygdommen forbundet med fotoreceptorerne gennem laboratorieundersøgelser og til yderligere klinisk anvendelse / transplantation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retinal organoid differentiering er en ønskelig metode til generering af rigelige funktionelle retinale celler. RO er en sammensætning af forskellige retinale celler, såsom ganglionceller, bipolære celler og fotoreceptorer, genereret af pluripotente stamceller mod den neurale nethinde 4,5,8,9. Selvom sammenflydende RO’er kan høstes, er det tidskrævende, hvilket kan kræve lange dyrkningsp…
Acknowledgements
Vi takker medlemmerne af 502 laboratoriet for deres tekniske støtte og nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev delvist støttet af Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) og National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo – Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
- Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).
- Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
- Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
- Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).
- Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286 (2015).
