Induction dirigée d’organoïdes rétiniens à partir de cellules souches pluripotentes humaines
Summary
En utilisant une méthode d’auto-organisation, nous développons un protocole avec l’ajout de COCO qui pourrait augmenter considérablement la génération de photorécepteurs.
Abstract
La transplantation de cellules rétiniennes est une approche thérapeutique prometteuse, qui pourrait restaurer l’architecture rétinienne et stabiliser ou même améliorer les capacités visuelles de la rétine dégénérée. Néanmoins, les progrès dans la thérapie de remplacement cellulaire se heurtent actuellement aux défis de la nécessité d’une source standard de rétines humaines standardisées et de haute qualité. Par conséquent, un protocole facile et stable est nécessaire pour les expériences. Ici, nous développons un protocole optimisé, basé sur une méthode d’auto-organisation avec l’utilisation de molécules exogènes et de réactif A ainsi que l’excision manuelle pour générer les organoïdes tridimensionnels de la rétine humaine (RO). L’OI dérivée des cellules souches pluripotentes humaines (CSP) exprime des marqueurs spécifiques pour les photorécepteurs. Avec l’ajout de COCO, un antagoniste multifonctionnel, l’efficacité de différenciation des précurseurs et des cônes photorécepteurs est considérablement augmentée. L’utilisation efficace de ce système, qui présente les avantages des lignées cellulaires et des cellules primaires, et sans les problèmes d’approvisionnement associés à ces dernières, pourrait produire des cellules rétiniennes confluentes, en particulier des photorécepteurs. Ainsi, la différenciation des CSP en OI fournit une plate-forme optimale et biopertinente pour la modélisation des maladies, le dépistage de médicaments et la transplantation cellulaire.
Introduction
Les cellules souches pluripotentes (CSP) se caractérisent par leur auto-renouvellement et leur capacité à se différencier en toutes sortes de cellules somatiques. Ainsi, les organoïdes dérivés des CSP sont devenus une ressource importante dans la recherche en médecine régénérative. La dégénérescence rétinienne est caractérisée par la perte de photorécepteurs (bâtonnets et cônes) et de pigment rétinien épithélium. Le remplacement des cellules rétiniennes pourrait être un traitement encourageant pour cette maladie. Cependant, il n’est pas possible d’obtenir des rétines humaines pour la recherche et le traitement des maladies. Par conséquent, les organoïdes rétiniens (RO) dérivés des CSP, qui récapitulent efficacement et avec succès les cellules rétiniennes natives multicouches, sont bénéfiques pour la recherche fondamentale et translationnelle 1,2,3. Nos recherches portent sur la différenciation de l’OI afin de fournir des cellules suffisantes et de qualité pour étudier la dégénérescence rétinienne4.
Les méthodes de différenciation des OI émergent continuellement, avec la différenciation tridimensionnelle (3D) des suspensions mise au point par le laboratoire Sasai en 20125. Nous avons introduit le marqueur CRX-tdTomato dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) pour suivre spécifiquement les cellules précurseurs des photorécepteurs et modifié la méthode avec l’ajout de COCO, un antagoniste multifonctionnel des voies Wnt, TGF-β et BMP6. Il a été démontré que COCO améliore efficacement l’efficacité de différenciation des précurseurs et cônes de photorécepteurs 6,7.
Dans l’ensemble, en modifiant la méthode classique de différenciation, nous avons développé un protocole accessible pour récolter des précurseurs et des cônes de photorécepteurs abondants à partir d’OI humaines pour analyser la maladie rétinienne associée aux photorécepteurs par des investigations en laboratoire et pour une application clinique / transplantation ultérieure.
Protocol
Representative Results
Discussion
La différenciation organoïde rétinienne est une méthode souhaitable pour la génération de cellules rétiniennes fonctionnelles amples. L’OI est un composite de différentes cellules rétiniennes, telles que les cellules ganglionnaires, les cellules bipolaires et les photorécepteurs, générés par les cellules souches pluripotentes vers la rétine neurale 4,5,8,9. Bien que les OI confl…
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire 502 pour leur soutien technique et leurs commentaires utiles concernant le manuscrit. Ce travail a été en partie soutenu par la Fondation municipale des sciences naturelles de Beijing (Z200014) et le National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo – Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
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