मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से रेटिना ऑर्गेनोइड्स का निर्देशित प्रेरण
Summary
एक स्व-आयोजन विधि का उपयोग करते हुए, हम सीओसीओ के अतिरिक्त एक प्रोटोकॉल विकसित करते हैं जो फोटोरिसेप्टर की पीढ़ी में काफी वृद्धि कर सकता है।
Abstract
रेटिना सेल प्रत्यारोपण एक आशाजनक चिकित्सीय दृष्टिकोण है, जो रेटिना आर्किटेक्चर को बहाल कर सकता है और विकृत रेटिना को दृश्य क्षमताओं को स्थिर या सुधार सकता है। फिर भी, सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी में प्रगति वर्तमान में उच्च गुणवत्ता और मानकीकृत मानव रेटिना के ऑफ-द-शेल्फ स्रोत की आवश्यकता की चुनौतियों का सामना करती है। इसलिए, प्रयोगों के लिए एक आसान और स्थिर प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। यहां, हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल विकसित करते हैं, जो बहिर्जात अणुओं और अभिकर्मक ए के उपयोग के साथ-साथ तीन आयामी मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स (आरओ) उत्पन्न करने के लिए मैनुअल एक्सिशन के साथ एक स्व-आयोजन विधि पर आधारित है। मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) -व्युत्पन्न आरओ फोटोरिसेप्टर के लिए विशिष्ट मार्कर व्यक्त करता है। सीओसीओ, एक बहुक्रियाशील विरोधी के अलावा, फोटोरिसेप्टर अग्रदूतों और शंकु की भेदभाव दक्षता में काफी वृद्धि हुई है। इस प्रणाली का कुशल उपयोग, जिसमें सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं के लाभ हैं, और उत्तरार्द्ध से जुड़े सोर्सिंग मुद्दों के बिना, कॉन्फ्लुएंट रेटिना कोशिकाओं, विशेष रूप से फोटोरिसेप्टर का उत्पादन कर सकते हैं। इस प्रकार, आरओ में पीएससी का भेदभाव रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग और सेल प्रत्यारोपण के लिए एक इष्टतम और जैव-प्रासंगिक मंच प्रदान करता है।
Introduction
प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) को उनके आत्म-नवीकरण और सभी प्रकार की दैहिक कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता की विशेषता है। इस प्रकार, पीएससी से प्राप्त ऑर्गेनोइड पुनर्योजी चिकित्सा अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण संसाधन बन गए हैं। रेटिना अपघटन को फोटोरिसेप्टर (छड़ और शंकु) और रेटिना वर्णक उपकला के नुकसान की विशेषता है। रेटिना सेल प्रतिस्थापन इस बीमारी के लिए एक उत्साहजनक उपचार हो सकता है। हालांकि, रोग अनुसंधान और चिकित्सा के लिए मानव रेटिना प्राप्त करना संभव नहीं है। इसलिए, पीएससी से प्राप्त रेटिना ऑर्गेनोइड्स (आरओ), जो बहु-स्तरीय देशी रेटिना कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से और सफलतापूर्वक पुन: व्यवस्थित करते हैं, बुनियादी और ट्रांसलेशनल अनुसंधान 1,2,3 के लिए फायदेमंद हैं। हमारा शोध रेटिना अपघटन 4 का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त और गुणवत्ता वाली कोशिकाएं प्रदान करने के लिए आरओ भेदभाव पर केंद्रितहै।
आरओ को अलग करने के तरीके लगातार उभर रहे हैं, 2012 में सासाई प्रयोगशाला द्वारा अग्रणी त्रि-आयामी (3 डी) निलंबन भेदभावके साथ। हमने विशेष रूप से फोटोरिसेप्टर अग्रदूत कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) में सीआरएक्स-टीडीटोमेटो टैग पेश किया और डब्ल्यूएनटी, टीजीएफ-β और बीएमपी मार्ग6 के बहुक्रियाशील विरोधी सीओसीओ के अतिरिक्त विधि को संशोधित किया। सीओसीओ को फोटोरिसेप्टर अग्रदूतों और शंकु 6,7 की भेदभाव दक्षता में कुशलतापूर्वक सुधार करने के लिए दिखाया गया है।
कुल मिलाकर, शास्त्रीय भेदभाव विधि को संशोधित करके, हमने प्रयोगशाला जांच के माध्यम से फोटोरिसेप्टर से जुड़े रेटिना रोग का विश्लेषण करने और आगे नैदानिक अनुप्रयोग / प्रत्यारोपण के लिए मानव आरओ से प्रचुर मात्रा में फोटोरिसेप्टर अग्रदूतों और शंकुओं की कटाई के लिए एक सुलभ प्रोटोकॉल विकसित किया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
रेटिना ऑर्गेनॉइड भेदभाव पर्याप्त कार्यात्मक रेटिना कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक वांछनीय विधि है। आरओ विभिन्न रेटिना कोशिकाओं का एक समग्र है, जैसे कि गैंग्लियन कोशिकाएं, द्विध्रुवी कोशिकाएं और फोटोर?…
Acknowledgements
हम पांडुलिपि के बारे में उनके तकनीकी समर्थन और सहायक टिप्पणियों के लिए 502 प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। यह काम आंशिक रूप से बीजिंग म्यूनिसिपल नेचुरल साइंस फाउंडेशन (जेड 200014) और चीन के राष्ट्रीय कुंजी आर एंड डी कार्यक्रम (2017वाईएफए0105300) द्वारा समर्थित था।
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo – Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
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