Induzione diretta di organoidi retinici da cellule staminali pluripotenti umane
Summary
Utilizzando un metodo auto-organizzante, sviluppiamo un protocollo con l’aggiunta di COCO che potrebbe aumentare significativamente la generazione di fotorecettori.
Abstract
Il trapianto di cellule retiniche è un approccio terapeutico promettente, che potrebbe ripristinare l’architettura retinica e stabilizzare o addirittura migliorare le capacità visive della retina degenerata. Tuttavia, i progressi nella terapia di sostituzione cellulare devono attualmente affrontare le sfide di richiedere una fonte pronta all’uso di retine umane standardizzate e di alta qualità. Pertanto, è necessario un protocollo facile e stabile per gli esperimenti. Qui, sviluppiamo un protocollo ottimizzato, basato su un metodo auto-organizzante con l’uso di molecole esogene e reagente A e l’escissione manuale per generare gli organoidi tridimensionali della retina umana (RO). La RO derivata dalle cellule staminali pluripotenti umane (PSC) esprime marcatori specifici per i fotorecettori. Con l’aggiunta di COCO, un antagonista multifunzionale, l’efficienza di differenziazione dei precursori e dei coni dei fotorecettori è significativamente aumentata. L’uso efficiente di questo sistema, che ha i vantaggi delle linee cellulari e delle cellule primarie, e senza i problemi di approvvigionamento associati a queste ultime, potrebbe produrre cellule retiniche confluenti, in particolare fotorecettori. Pertanto, la differenziazione delle PSC in RO fornisce una piattaforma ottimale e biorilevante per la modellizzazione della malattia, lo screening farmacologico e il trapianto di cellule.
Introduction
Le cellule staminali pluripotenti (PSC) sono caratterizzate dal loro auto-rinnovamento e dalla capacità di differenziarsi in tutti i tipi di cellule somatiche. Pertanto, gli organoidi derivati dalle PSC sono diventati una risorsa importante nella ricerca sulla medicina rigenerativa. La degenerazione retinica è caratterizzata dalla perdita di fotorecettori (coni e bastoncelli) e dall’epitelio pigmentato retinico. La sostituzione delle cellule retiniche potrebbe essere un trattamento incoraggiante per questa malattia. Tuttavia, non è possibile ottenere retine umane per la ricerca e la terapia della malattia. Pertanto, gli organoidi retinici (RO) derivati dalle PSC, che ricapitolano efficacemente e con successo le cellule retiniche native multistrato, sono utili per la ricerca di base e traslazionale 1,2,3. La nostra ricerca si concentra sulla differenziazione RO per fornire cellule sufficienti e di qualità per studiare la degenerazione retinica4.
I metodi per differenziare i RO stanno emergendo continuamente, con la differenziazione tridimensionale (3D) delle sospensioni sperimentata dal laboratorio Sasai nel 20125. Abbiamo introdotto il tag CRX-tdTomato nelle cellule staminali embrionali umane (hESC) per tracciare specificamente le cellule precursori dei fotorecettori e modificato il metodo con l’aggiunta di COCO, un antagonista multifunzionale dei percorsi Wnt, TGF-β e BMP6. COCO ha dimostrato di migliorare efficacemente l’efficienza di differenziazione dei precursori e dei coni dei fotorecettori 6,7.
Complessivamente, modificando il metodo di differenziazione classico, abbiamo sviluppato un protocollo accessibile per raccogliere abbondanti precursori e coni di fotorecettori da RO umane per analizzare la malattia retinica associata ai fotorecettori attraverso indagini di laboratorio e per ulteriori applicazioni cliniche / trapianti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La differenziazione organoide retinica è un metodo auspicabile per la generazione di ampie cellule retiniche funzionali. Il RO è un composto di diverse cellule retiniche, come cellule ganglionari, cellule bipolari e fotorecettori, generate da cellule staminali pluripotenti verso la retina neurale 4,5,8,9. Sebbene i RO confluenti possano essere raccolti, richiede molto tempo, il che può richi…
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio 502 per il loro supporto tecnico e i commenti utili riguardanti il manoscritto. Questo lavoro è stato in parte supportato dalla Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) e dal National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo – Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
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